Måle fluks av mineral næringsstoffer og miljøgifter i Planter med radioaktive tracere

Summary

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Abstract

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Introduction

Den opptak og fordeling av næringsstoffer og toksikanter sterkt påvirker plantevekst. Følgelig etterforskningen av underliggende transportprosesser utgjør et stort område av forskning i plantebiologi og landbruksvitenskap ^1,2, spesielt i sammenhenger av ernæringsoptimalisering og miljømessige påkjenninger (f.eks salt stress, ammonium toksisitet). Den fremste blant metoder for måling av fluksene i planter er bruk av radioisotopiske sporstoff, som ble utviklet i 1950-årene betraktelig (se eksempel ³⁾ og fortsetter å være mye brukt i dag. Andre metoder, slik som måling av næringsutarming fra roten medium og / eller akkumulering i vev, bruk av ione-selektive vibrerende mikroelektroder som mife (microelectrode ion fluks estimering) og siet (skanning ion-selektiv elektrode teknikk), og bruk av ion-selektive fluorescerende fargestoffer, er også mye brukt, men er begrenset i sin evne til å oppdage nettet influensaxes (dvs. forskjellen mellom tilstrømningen og effluks). Bruken av radioisotoper, på den annen side, gjør det mulig for forskeren den unike evne til å isolere og kvantifisere ensrettede fluks, som kan brukes til å løse kinetiske parametere (for eksempel K _M og V _maks), og gi innsikt i kapasiteten, energetics, mekanismer, og regulering, av transportsystemene. Ensrettede fluks målinger gjort med radiotracers er spesielt nyttig under forhold hvor forandring i den motsatte retning er høy, og omsetningen av intracellulære bassenger er rask ^4. Videre radio-metoder tillater målinger å bli utført under relativt høye konsentrasjoner substrat, i motsetning til mange andre teknikker (se Diskusjon ', nedenfor), fordi spores isotopen er observert mot en bakgrunn av en annen isotop av det samme element.

Her gir vi en detaljert fremgangsmåte for radioisotopisk måling av enveis og nET fluks av mineralske næringsstoffer og miljøgifter i intakte planter. Det vil bli gjort på fluks måling av kalium (K ^+), et anlegg som makronæringsstoff ^5, og ammoniakk / ammonium (NH ₃ / _NH4 ^+), en annen som makronæringsstoff er imidlertid toksisk når den er tilstede i høye konsentrasjoner (f.eks, 1- 10 mM) ^2. Vi vil bruke de radioisotoper ⁴² K ⁺ (t _1/2 = 12.36 timer) og ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ⁺ (t _1/2 = 9,98 min), henholdsvis i intakte frøplanter av modellsystemet bygg (Hordeum vulgare L .), i beskrivelsen av to nøkkel protokoller: direkte tilstrømning (DI) og kompartment analyse ved tracer effluks (Cate). Vi bør merke fra begynnelsen at denne artikkelen beskriver bare de nødvendige skritt for å utføre hver protokoll. Der det er hensiktsmessig, er korte forklaringer på beregninger og teori forutsatt, men detaljerte utstillinger av hver teknikk'S bakgrunn og teori kan finnes i flere viktige artikler om emnet ^4,6-9. Viktigere, disse protokollene er bredt overførbar til flux analyse av andre næringsstoffer / giftstoffer (for eksempel ²⁴ Na ^{+, 22} Na ^{+, 86} Rb ^{+, 13} NO ₃ ^-) og til andre plantearter, om enn med noen advarsler (se nedenfor) . Vi understreker også viktigheten av at alle forskere som arbeider med radioaktive materialer må arbeide under en lisens ordnet gjennom deres institusjonens ioniserende stråling sikkerhetsmyndighet.

Protocol

1. Plant Kultur og klargjøring Grow bygg frøplanter hydroponically for 7 dager på klima-kontrollerte vekstkammer (for detaljer, se 10). MERK: Det er viktig å vurdere å undersøke planter på en rekke utviklingsstadier, som næringsbehov vil endre seg med alderen. En dag før eksperimentering, pakke flere frøplanter sammen for å lage en enkelt replikere (tre planter per bunt for DI, 6 planter per bunt Cate). Bundle frøplanter ved å pakke en 2 cm stykke av Tygon rør r…

Representative Results

Figur 1 viser isotermer funnet ved hjelp av DI teknikk (med 13 N), for tilstrømningen av NH 3 til røttene av intakte bygg frøplanter dyrket ved høy (10 mm) NH 4 +, og enten lav (0,02 mm) eller høy (5 mm ) K +. De viser isotermer Michaelis-Menten-kinetikk ved NH 3 flukser er plottet som en funksjon av ytre NH3 konsentrasjon ([NH3] ekst; justert med forandringer i pH 13). NH 3 flukser var sig…

Discussion

Som vist i eksemplene ovenfor, er den radiomerkingsmetode et kraftig middel til å måle ensrettede fluks av næringsstoffer og miljøgifter i planta. Figur 1 viser at NH ₃ tilstrømningen kan nå i overkant av 225 mikromol g ^-1 t ^-1, som er kanskje den høyeste bona fide transmembrane flux noen gang er rapportert i et anlegg system ^13, men omfanget av dette flux ville ikke være synlig hvis bare netto fluks ble målt. Dette skyldes at en sto…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Gamma counter	Perkin Elmer		Model: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counter	Ludlum Measurements Inc.		Model 3 survey meter
400-mL glass beakers	VWR	89000-206	For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnel	VWR	89000-466	For efflux funnel
Large tubing	VWR	529297	For efflux funnel
Medium tubing	VWR	684783	For bundling
Small tubing	VWR	63013-541	For aeration
Aeration manifold	Penn Plax Air Tech	vat 5.5	To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vials	VWR	66022-128	For gamma counting
Glass centrifuge tubes	VWR	47729-576	For spin-drying root samples
Kimwipes	VWR	470173-504	For spin-drying root samples
Dissecting scissors	VWR	470001-828
Forceps	VWR	470005-496
Low-speed clinical centrifuge	International Equipment Co.	76466M-4	For spin-drying root samples
1-mL pipette	Gilson	F144493
10-mL pipette	Gilson	F144494
1-mL pipette tips	VWR	89079-470
10-mL pipette tips	VWR	89087-532
Analytical balance	Mettler toledo	PB403-S/FACT