Beställa enskilda celler och Single Embryon i 3D Förlossning: En ny enhet för hög halt Screening
Summary
Vi rapporterar en anordning och en ny metod för att studera celler och embryon. Enstaka celler exakt beställas i mikrokavitet matriser. Deras 3D förlossning är ett steg mot 3D-miljöer förekommer i fysiologiska förhållanden och tillåter organell orientering. Genom att kontrollera cellens form, minimerar denna inställning variabilitet redovisas i standardanalyser.
Abstract
Biologiska celler visar sig vanligtvis på platta (2D) ytor. Detta villkor inte är fysiologiska, och fenotyper och former är mycket variabla. Screening baserad på celler i sådana miljöer har därför allvarliga begränsningar: cellorganeller visar extrema fenotyper, cell morfologier och storlekar är heterogena och / eller specifika cellorganeller kan inte ordentligt. Dessutom är celler in vivo som ligger i en 3D-miljö; i denna situation, celler visar olika fenotyper främst på grund av deras interaktion med den omgivande extracellulära matrix av vävnaden. För att standardisera och skapa ordning av enskilda celler i en fysiologiskt relevant 3D-miljö för cellbaserade analyser, rapporterar vi här mikro och applikationer av en anordning för in vitro 3D cellkultur. Denna anordning består av en 2D matris med mikrokaviteter (typiskt 10 5 håligheter / cm 2), var och en fylld med enskilda celler eller embryon. cell posining, form, polaritet och intern cell organisation blir då normaliserade visar en 3D-arkitektur. Vi använde replik gjutning mönster en rad mikrokaviteter, "äggkoppar", på ett tunt polydimetylsiloxan (PDMS) skikt vidhäftat på ett täckglas. Karies täcktes med fibronektin för att underlätta vidhäftning. Celler infördes genom centrifugering. Fyllnings procentsats optimeras för varje system som möjliggör upp till 80%. Celler och embryon viabilitet bekräftades. Vi tillämpade denna metod för visualisering av cellulära organeller, såsom kärnan och Golgi-apparaten, och för att studera aktiva processer, såsom stängningen av cytokinetic ringen under celldelning. Denna anordning tillät identifiering av nya funktioner, såsom periodiska ansamlingar och inhomogeniteter av myosin och aktin under cytokinetic ringslutning och kompakterade fenotyper för Golgi och kärnan anpassning. Vi kännetecknas metoden för däggdjursceller, fission jäst, knoppande jäst, C. elegans wed särskild anpassning i varje enskilt fall. Slutligen egenskaperna hos denna enhet gör det särskilt intressant för läkemedelsscreeningsanalyser och personlig medicin.
Introduction
Ström in vitro cellbaserade analyser är två-dimensionell (2D). Denna konfiguration är inte naturligt för däggdjursceller och därför inte är fysiologiskt relevant en; celler visar en mångfald av former, storlekar och heterogena fenotyper. De presenterar ytterligare allvarliga begränsningar när det tillämpas på screeningsapplikationer, såsom en oordnad fördelning inom planet och extrema fenotyper av cellulära organeller (stress fibrer, i synnerhet). Detta är särskilt viktigt i kliniska försök för drogtestning, där höga budgetar spenderas varje år. De flesta av dessa läkemedel men misslyckas när de tillämpas på djurmodeller på grund av den konstgjorda 2D odlingsbetingelser i tidiga skeden av läkemedelsscreening. Dessutom, genom att använda detta tillvägagångssätt, specifika cellorganeller kan inte vara korrekt visualiseras, såsom cytokinetic aktomyosin ringen under cellmitos, och i allmänhet strukturer som utvecklas i planet vinkelrätt mot planet för observation. Någranya 2D-analyser har föreslagits för att övervinna de ovan nämnda nackdelarna och viktiga insikter om cytoskelettet organisation har observerats 2,3. Dessa analyser fortfarande finns en allvarlig begränsning: celler visar en mycket spritt fenotyp i motsats till vad som observerats in vivo, där celler presenterar en 3D-arkitektur. Dessa artefakter i samband med odlingsmetoden kan utlösa icke-fysiologiska funktioner såsom förbättrade spänningsfibrer 1,4,5.
Tredimensionella cellodlingsanalyser ge flera fördelar jämfört med 2D-miljöer 6,7. De är fysiologiskt mer relevant, och resultaten är därför meningsfulla. Som ett exempel kan celler inbäddade i hydrogeler visar 3D-liknande strukturer men deras morfologier skiljer sig från en cell till en annan 8,9. Men deras morfologier skiljer sig från en cell till en annan, vilket försvårar screening program. En alternativ strategi är att bädda endaceller i mikrofabricerade hålrum 10,11. Cell läge, form, polaritet och intern cell organisation kan då bli normaliseras. Förutom att ge 3D-liknande arkitektur till celler, mikrokaviteter möjliggör också hög innehåll screeningstudier 10,12-14; enskilda celler kan beställas till mikromatriser och cellulära organeller och deras utvecklingar kan observeras parallellt. Denna regelbundenhet ger bra statistik med lågt antal celler och bättre tids / rumsliga upplösningar. Användbara föreningar är lättare att identifiera ett tillförlitligt sätt.
I denna studie visar vi tillverkning och tillämpning av en ny 3D-liknande enda celler odlingssystem för hög halt screening program 10,12,13. Anordningen består av en uppsättning av elastomer mikrokaviteter (10 5 håligheter / cm2), myntade "äggkoppar" (EG). Dimensioner och totala volymen av EG i detta arbete är optimerade för den typiska volym av enskilda NIH3T3 och HeLa-cellerunder celldelning. Morfologin hos håligheterna – cylindriska – väljs för att på rätt sätt orientera cellform för visualisering av aktiva processer. Replik gjutning används för att mönstra en rad EG på ett tunt polydimetylsiloxan (PDMS) skikt vidhäftat på ett täckglas 15,16. Cellerna införs i EG genom centrifugering. Vi rapporterar här observation och normalisering av cellorganeller (aktin spänningsfibrer, Golgiapparaten och nucleus) i 3D (EG) i jämförelse med samma celler på 2D (flat) ytor. Vi rapporterar också observation av aktiva dynamiska processer såsom stängningen av cytokinetic aktomyosin ringen under celldelning 17. Slutligen visar vi resultatet av denna metod på andra system med stela väggar, såsom knoppande jäst, fissionsjäst och C. elegans embryon som bekräftar tillämpligheten av vår metodik för ett brett spektrum av modellsystem.
Vi presenterar nästa en detaljerad och uttömmande protocol i syfte att tillverka och tillämpa "äggkoppar" för 3D mikro. Vår inställning är enkel och inte behöver ett rent rum. Vi räknar med att denna nya metod kommer att vara särskilt intressant för läkemedelsscreeningsanalyser och personlig medicin, i utbyte av petriskålar. Slutligen kommer vår anordning att vara användbara för att studera fördelningen av celler svar på yttre stimuli, exempelvis i cancer 18 eller i grundforskning 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Replika gjutning användes för att fabricera de "eggcups '. Tillverkningsprocessen behöver inte ett rent rum; det är snabbt och enkelt, även om vissa metoder kan behövas. I synnerhet släppa PDMS stämpel är det mest kritiska steget för att producera ett stort område med hög kvalitet "äggkoppar". Av denna anledning har särskild omsorg som skall vidtas i detta steg. Om det här steget upprepade gånger misslyckas, anser att optimera plasma renare parametrar före den silanisering och bindnin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner L. Brino (IGBMC hög halt Screening anläggning, Illkirch, Frankrike) för att förse oss med den anti-Giantin antikropp, M. Labouesse Lab. för C. elegans (IGBMC) och B. Séraphin Lab. för knoppande jäst (IGBMC), E. Paluch och A. Hyman för fluorescerande HeLa-celler (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) och JQ Wu (Ohio State University) för fission jästceller; A. Hoel och F. Evenou för experimentell hjälp, C. Rick (IBMC, Strasbourg, Frankrike) för teknisk hjälp, och JC Jeannot (Femto-st, Frankrike) för att få hjälp i mikro. Detta arbete stöddes av medel från CNRS, universitetet i Strasbourg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale och ci-FRC i Strasbourg.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
- Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
- Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
- Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
- Riveline, D., Buguin, A. . Devices and methods for observing the cell division. , (2010).
- Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
- Riveline, D. . Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , (2012).
- Riveline, D., Wollrab, V. . Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , (2012).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
- Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G., Hughes, M. P., Hoettges, K. F. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. 583, 81-107 (2010).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
- Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
- Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
- Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
- Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
- Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
- Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
- Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
- Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
- Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
- Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
- Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).
