형질 전환의 세대 히드라 배아 미세 주입에 의해

요약

안정적으로 형질전환 히드라는 플라스미드 DNA를 배아에 미세주입한 후 무작위 게놈 통합과 무성 증식을 통해 균일한 계통을 형성합니다. 형질전환 히드라(Transgenic Hydra)는 세포 이동을 추적하거나, 유전자를 과발현하거나, 프로모터 기능을 연구하거나, RNAi를 사용하여 유전자 발현을 녹다운하는 데 사용됩니다.

초록

모든 양측성의 자매 그룹인 Cnidaria 문의 일원인 Hydra는 다세포 동물들 사이에서 공유되는 기본적인 생물학적 과정에 대해 밝힐 수 있습니다. Hydra는 재생, 패턴 형성 및 줄기 세포 연구의 모델로 사용됩니다. 그러나 분자 기능을 연구하기 위한 유전자 교란에 대한 신뢰할 수 있는 방법이 없기 때문에 연구 노력이 방해를 받고 있습니다. 형질전환 방법의 개발은 히드라 생물학 연구에 활력을 불어넣었다¹. 형질전환 Hydra를 사용하면 살아있는 세포를 추적하고, 생화학적 분석을 위한 순수 세포 집단을 생성하기 위한 분류, 넉다운 및 과발현에 의한 유전자 기능 조작, 프로모터 기능 분석을 수행할 수 있습니다. 초기 단계 배아에 주입된 플라스미드 DNA는 발달 초기에 게놈에 무작위로 통합됩니다. 그 결과 부화한 새끼는 세 가지 계통(외배엽 상피, 내배엽 상피 또는 간질) 중 하나 이상의 조직 패치에서 전이유전자를 발현합니다. 형질전환 조직을 가진 부화한 새끼를 얻는 성공률은 10%에서 20% 사이입니다. 형질전환 부화한 새끼의 무성 번식은 특정 계통에서 균일하게 형질전환 계통을 설정하는 데 사용됩니다. 형질전환 Hydra를 생성하는 것은 놀라울 정도로 간단하고 강력하며, 여기에서는 저렴한 비용으로 쉽게 구현할 수 있는 프로토콜에 대해 설명합니다.

서론

히드라 재생, 패턴 형성을 연구하고, 약 250년 ^2에 대한 줄기 세포에 사용 된 히드라 세 세포 계보로 구성된 간단한 몸 계획이 있습니다. 외배엽 상피, 내배엽 상피와 간질을. 관형 본체는 하나의 셀 층 각각 외배엽과 내배엽 상피 계통에 의해 형성된다. 신체 열에있는 상피 세포의 유사 분열 모두이다. 상피 세포가 사지 ^3으로 변위되는 경우, 반구 끝에 경구 단부 또는 피트 (기저 디스크)에서 헤드 (입과 촉수), 이들은 세포주기의 G2 단계에서 체포 세포 운명 ^{4 변경.} 간질 혈통의 세포는 상피 세포 사이의 간극 내에 상주. 이 계보는 몸의 열 ^다섯의 외배엽 상피 층에있는 다 능성 줄기 세포에 의해 지원됩니다. 격자 간 줄기 세포는 체세포 세 CEL을 야기리터 유형 (신경, 동맥 세포 및 nematocytes)와 생식 세포 ^6,7.

분류학상의 문 자포의 일원으로서, 모든 bilaterians에 자매 그룹은 히드라는 다세포 동물에서 공유 근본적인 생물학적 과정에 빛을 발산 할 수 있습니다. 최근까지, 이러한 노력은 유전자 기능의 신뢰성 섭동 방법의 부족에 의해 방해 하였다. 그러나, 형질 전환 ....

프로토콜

플라스미드 DNA, 바늘, 및 사출 식기 1 준비

1. 전용선 또는 맥시 미디 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하고 ML 에탄올 침전을 사용하여 / 2.5 mg의 DNA를 집중한다. DNA 펠렛 클레아없는 탈 이온수에 용해한다. -20 ° C에서 10 ~ 20 ㎕의 분취 량의 DNA를 저장합니다. (가능한 벡터의리스트 보충 표 1 참조)
2. 100 × 15mm 페트리 접시에 배아를 유지하기위한 저점을 구성하는 아가 로스 사용하여 사출 요리를합니다.
   1. 각도 100 × 15mm 배양 접시에 75 × 50 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 아가로 오스 페트리 접시에 히드라 매체 ^(24)에서 용융 2 %의 약 50 ㎖에 붓고. 또한, 첫번째 접시에 아가 로스를 부어 상단에 "미세 주입 물고기 금형"을 떠.
   2. 아가로 오스가 고형화 된 후, 유리 슬라이드 나 주형을 제거한다. 유리 슬라이드가 사용 된 경우, 면도날 즐로 아가로 오스를 초과 절취드 벽을 형성한다. 접시에 히드라 매체를 붓고 즉시 사용하거나 필요할 때까지 4 ° C에 보관합니다. 참고 : 사용하는 사이에 4 ° C에 저장하는 경우 사출 요리를 재사용 할 수 있습니다.

결과

형질 전환 하이 드라 라인 구축

아테 미아 노 플리 우스와 함께 2-3 일마다 형질 전환 새끼 피드. 부화 한 새끼는 때때로 부화 후 하루나 이틀 동안 먹지 않는다. 일부 새 새끼는 살아남지 못할 것이다, 따라서 식사를하지 않으며, 않습니다. 갓 부화가 외배엽 (그림 1A) 중 하나의 형질 전환 또는 내배엽 상피 조직의 경우, 동물이 꽃 봉오리 가장 형질 전환 조직 (그림 1B, C)이 싹을 수집 할 수 있습니다. 형질 전환 라인이 외배엽 (그림 1D) 또는 내배엽 상피 계통 중 하나의 유전자의 균일 한 표정으로 설립 될 때까지 새로운 싹이 작업을 수행하기 위해 계속합니다. 동시에, 두 번째 줄은 형질 전환 유전자를 포함하지만, 그 유전자 (그림 1B)와 동일하지 않도록 설정할 수 있습니다. 이 줄은 향후 실험 대조군 역할을합니다.......

토론

히드라는 정기적으로 무성하게 재현하지만, 생산 배우자를 시작합니다 환경 자극을 필요로한다. 이러한 자극은 대부분의 하이 드라 종에 대해 잘 정의되지 않고 변형에 변형과 다를 수 있습니다. 성적인 될 히드라을 유도 실험실 환경에서 어려울 수 있기 때문에 형질 히드라의 생산에 상당한 장애물 정기적 배아를 획득한다. AEP 균주 ^{25 그러나,} 실험실에서 쉽게 배우자를 생성하고이 지금까지 유전자 변형 라인을 만들기 위해 사용 된 유일한 변형이다. 생식 세포의 생산을 유도하는 가장 일반적인 방법은 다이어트에 의해 조작된다. 전술 한 바와 같이, 동물 오일 절식 3 주 동안 매일 공급해야하고 시간 생식 ^1을 제조 될 때, 두번 주 공급. 또한 아마도 MOR을 시뮬레이션 수족관 ^(26)에 수직 판에 AEP 히드라를 배양 우리의 경험이었다즉 자연 환경, 동물을 정기적으로 공급하는 경우에도 산란율로 이끈다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AEP Hydra Strain			이메일: celina.juliano@yale.edu 의 Celina Juliano 또는 Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
고속 맥시 키트	Qiagen	12662
100 x 15mm 페트리 접시	BD 팔콘	351029
75 x 50mm 유리 현미경 슬라이드	시그마	CLS294775X50
미세 사출 물고기 금형	IBI Scientific	FM-600
붕규산 유리(필라멘트	셔터 포함	BF100-50-10	O.D.: 1.0mm, I.D.: 0.50mm, 10cm 길이
화염/갈색 마이크로피펫 풀러	셔터 기기	P-97
페놀 레드	시그마	P3532
보석상 집게, Durmont #5	Sigma	F6521
메스 블레이드 #15	Fisher	50-822-421
미네랄 오일	시그마	M8410-500ML
마이크로 인젝터	Narishige	IM-9B
마그네틱 스탠드	Narishige	GJ-1
철판	Narishige	IP
조이스틱 마이크로 매니퓰레이터	Narishige	MN-151

)