gDNA Tilsætning af en transposase-baseret teknologi til NGS Analyse af den samlede sekvens af<em> BRCA1</em><em> BRCA2</em>, og 9 gener involveret i DNA beskadigelse reparation
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
Den udbredte brug af Next Generation Sequencing har åbnet nye muligheder for kræftforskning og diagnose. NGS vil bringe enorme mængder af nye data om kræft, og især kræft genetik. Nuværende viden og fremtidige opdagelser vil gøre det nødvendigt at undersøge et stort antal gener, der kunne være involveret i en genetisk disposition til kræft. I denne forbindelse har vi udviklet et NEXTERA design at studere 11 komplette gener involveret i DNA beskadigelse reparation. Denne protokol blev udviklet til sikkert studere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 og TP53) fra promotor til 3'-UTR i 24 patienter samtidigt. Denne protokol, der er baseret på transposasen teknologi og gDNA berigelse, giver en stor fordel i form af tid til genetisk diagnose takket være prøve multiplexing. Denne protokol kan sikkert bruges med blod gDNA.
Introduction
I 2010 næsten 1,5 millioner mennesker (primært kvinder) udviklede brystkræft i hele verden. Det anslås, at 5 til 10% af disse tilfælde var arvelig. Næsten 20 år siden blev BRCA1 og BRCA2 identificeret som involveret i arvelig brystkræft og ovariecancer 1. Da omkring 15 år siden, har BRCA1 og BRCA2 kodningsregioner blevet sekventeret for at bestemme den genetiske disposition til brystkræft og ovariecancer. Ændringer i BRCA1 og BRCA2 detekteres i 10 til 20% af udvalgte familier 2 tyder på, at analysen af disse regioner er ikke tilstrækkeligt til en effektiv screening. For nylig analyse af ikke-kodende sekvenser (promoter, introner, 3-'UTR) af BRCA1 og BRCA2 fremhævet, at nye mutationer / variationer kunne knyttes til en højere risiko for brystkræft 3-6.
BRCA1 og BRCA2 proteiner er involveret i homolog rekombination Reparation (HHR), som suppleres af mange samarbejdspartnere 7. Mens ændringer i BRCA1 eller BRCA2 inducere defekter i DNA-reparation, kan de andre partnere også påvirke risikoen for brystkræft. Denne hypotese synes at være blevet valideret siden BRIP1 8 og PALB2 9 har en dokumenteret effekt på livmoderhalskræft og brystkræft, hhv. Desuden kan to andre "moderat risiko" brystkræft modtagelighed gener, ATM og CHEK2, også undersøges rutinemæssigt 10.
I forlængelse af disse undersøgelser, besluttede vi at udvikle en protokol til at analysere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 og TP53) i 24 patienter samtidig benytter et meget let og forholdsvis hurtig protokol baseret på transposasen teknologi, med berigelse og sekventering på et medium gennemløb enhed. Takdenne teknik, vi sekventeret komplette gener fra starten af promotoren til enden af 3'-UTR undtagen RAP80, for hvilket et intronisk region 2.500 bp ikke var dækket (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Dette udgør i alt omkring 1.000.300 bp studeret med 2.734 sonder. Normalt er BRCA1 og BRCA2 exonic sekvenser analyseret ved Sanger sekventering, som har brug for 1,5 måneder for mindre end 20 patienter. Med den nuværende protokol (figur 1), i samme tid, 11 komplette gener for mere end 75 patienter kunne analyseres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den udbredte brug af NGS enheder og teknologier har givet nye muligheder i studiet af kræft og genetiske sygdomme. Ud over hele genomsekvensering eller RNA sekventering, analyse af en stor mængde af udvalgte gDNA sekvenser i mange patienter, som samtidig giver store perspektiver i diagnosen. Her har vi udviklet et specifikt design (tilgængelige on-demand) ved hjælp NEXTERA teknologi til at studere 11 komplette gener hos 24 patienter samtidig med en mellemlang anordning throughput sekventering (Table of Materials / u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3’UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- . The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).
