のマイクロインジェクション法<em> Patiria minata</em>接合体
Summary
モルファント胚を生産する方法は、発生メカニズムや遺伝子制御ネットワークを研究するために不可欠である。海の星Patiria miniataはこれらの研究のための新たなモデル系である。ここでは、胚の培養液を生産、配偶子を取得するためのプロトコルを提示しており、この種から接合体の急速なマイクロインジェクション。
Abstract
棘皮動物は、長い生殖と発達の研究のための好みのモデルシステムであって、より最近では発生過程の遺伝子調節と進化の研究のためにしている。海の星、Patiria miniataは 、以前にウニ、StrongylocentrotusのpurpuratusとLytechinus variegatusでほぼ独占的に実施された研究は、これらのタイプのためのモデル系としての有病率を集めています。これらのモデル系の利点は、特定の遺伝子がアップまたはダウンレギュレートされている修飾された胚、細胞群を標識する、またはレポーター遺伝子を導入することを生産する容易さである。単一のマイクロインジェクション法は、そのような改変された胚の多種多様を作成することが可能である。ここでは、Pから配偶子を得るための方法を提示miniata、接合体の生産、およびマイクロインジェクションを介して、摂動の試薬 を導入する。健康なモルファント胚はその後、GEの定量的および定性的研究のために隔離されているNEの機能。この生物のためのゲノム及びトランスクリプトームデータの利用が行われた研究し、それらを実行の容易さの種類が増加している。
Introduction
（一般的にバットのスターとして知られている）、海の星、Patiria miniataは 、6〜8の進化の4,5発達セルラー1-3さまざまな、、、と生態研究の9〜11のために興味深く、汎用性の高いモデル系として浮上している。大人P. miniataバハカリフォルニア州から12のシトカ、アラスカから太平洋岸に沿って分布していると容易に海洋水槽で維持される。卵母細胞を得一年中であり、それぞれの女性は、数万の卵万のを流すことができます。卵母細胞は、容易に成熟し、外部から13受精されている。生じた胚は容易な観察を可能にする透明であり;彼らは同期的に開発し、開発のための唯一の海水を必要とします。全ゲノムアセンブリおよび複数のトランスクリプトームはまた、P.ご利用いただけますminiata（ Echinobase.org ）。このような利点は、研究の範囲に最適ですおよび教育目的。
近年では、P。 miniataが発生遺伝子制御ネットワークのモデル系が14〜16を分析するとなっています。このような研究の目的は、調節遺伝子の全体の賛辞を特定し、それらの相互作用のネットワークを決定することです。この仕事の多くは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入によって、またはインビトロ合成されたmRNA の遺伝子発現を乱すことを伴う。さらに、 シス調節因子の分析は、調節DNA 15の機能を特徴付けるために使用される。これらの分析は、摂動試薬および/またはDNAレポーターは胚に構築の導入を必要とします。さらに、これらの摂動の下流効果を特徴付けるために、一つの潜在的標的の遺伝子発現の変化のために多くの胚を分析しなければならない。受精卵の数百のマイクロインジェクションのための技術は、この作品のための中心である。
P.含む棘皮動物、 miniata </em>の、性的に成熟するために何ヶ月を必要とします。このために、実験のためのこれらの動物のトランスジェニック系統を開発し、維持するために、一般的には実用的ではない。したがって、トランスジェニック大人の繁殖を効率的に修正された胚を作成することはできません。その代わりに、摂動は、マイクロインジェクションを介して新たに発生する必要があります。マイクロインジェクションは細胞透過性ではない試薬で胚を修正する機会を提供しています。以下のプロトコルは、マイクロインジェクションを介して座って1〜3時間で受精卵の数百にDNA、mRNAは、細胞トレーサー、およびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入する方法を説明している。これは、in situハイブリダイゼーション 、RNA-配列、およびウェスタンブロットで 、含む下流の実験のさまざまな十分な材料を生成するが、これらに限定されない、定量PCR。
Protocol
Representative Results
Discussion
この技術の初心者ユーザーにとっては難しいですが、成功したモルファント胚を作成するために不可欠であるつの重要なステップがあります。最初は成熟し、適切に受精されます健康的な卵母細胞を選択している。培養中の正常な発達の割合は季節によって異なり、動物の健康、および卵母細胞は、単一の個体から採取された回数。卵母細胞は、10月まで4月から、より良い品質のものになる?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、全米科学財団、IOSおよびIOS 0844948 1024811によってサポートされていました
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
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