Fjerning av øynene, også kalt enucleation, gir en nyttig strategi for å studere aspekter av visuell, kryss-modal og utviklings plastisitet langs pattedyr visuelle systemet siden det fremkaller irreversibel delvis (monocular) eller fullstendig (kikkerten) synstap. Her beskriver vi en svært reproduserbare og grei tilnærming til å utføre in vivo enucleation.
Utskraping eller kirurgisk fjerning av et øye, kan generelt betraktes som en modell for nerve deafferentation. Det gir et verdifullt verktøy for å studere ulike aspekter av visuell, kryss-modal og utviklings plastisitet langs pattedyr visuelle systemet 1-4.
Her kan vi vise en elegant og enkel teknikk for fjerning av ett eller begge øyne hos mus, som er validert i mus av 20 dager gamle inntil voksne. I korthet blir en desinfiserte buet pinsett brukes til å klemme den optiske nerven bak øyet. Deretter er sirkulære bevegelser utført for å innsnevre synsnerven og fjerne øyeeplet. Fordelen med denne teknikken er høy reproduserbarhet, minimal til ingen blødning, hurtig postoperative og en meget lav terskel for læring experimenter. Derfor kan en stor mengde av dyrene bli manipulert, og bearbeidet med minimal anstrengelse. Naturen av teknikken kan indusere svak skadenetthinnen i løpet av prosedyren. Denne bivirkningen gjør denne metoden mindre egnet i forhold til Mahajan et al. (2011) 5 hvis målet er å samle inn og analysere retinal vev. Dessuten er vår metode begrenset til post-øye åpning aldre (mus: P10 – 13 og utover) siden øyeeplet må fortrenges fra stikkontakten uten å fjerne øyelokkene. In vivo enucleation teknikk beskrevet i dette manuskriptet har nylig blitt brukt med mindre endringer i rotter og synes nyttig å studere afferent visuelle vei av gnagere generelt.
Fjerne et øye og dermed irreversibelt ødeleggende sensoriske receptor overflate (retina), pålegger et betydelig tap av sanseinntrykk langs den visuelle veien. Den enucleation modellen i juvenil og voksen visuelle systemet har vist seg å være verdifulle i å forstå utvikling, plastisitet og funksjon av ulike visuelle sentre 1-4. De molekylære, cellulære og fysiologiske konsekvensene av denne sensorisk deprivasjon kan gi innsikt i hvordan normal utvikling er regulert og hvor etablert cortical kretser håndtere og endre sin struktur og funksjon som svar på en slik omfattende endring i opplevelsen.
Ulike metoder for visuell deprivasjon finnes og de har alle sine spesifikke fordeler i visjon relatert forskning. For eksempel mørk oppdragelse spesielt eliminerer visuelt drevet aktivitet, men det påvirker ikke den spontane retinal aktivitet. Tilsvarende lokk sting eller øyelapper fjerne mønstret visual inngang uten å forstyrre spontan aktivitet, men de tillater spredt lys penetrasjon gjennom lukkede øyne. Disse metoder er reversible og har vist seg å være verdifulle i å forstå rollen til mønstrede syn-og lav-nivå korrelasjon av binokulære innganger i forme kortikale kretser under utvikling 6-8. I glaukom forskning, har den optiske nerven knuse modell hos voksne dyr blitt mye brukt fordi det etablerer et progressivt tap av netthinnens ganglion celle innganger som utgjør den optiske nerven 9,10. På den annen side, enucleation, hvor blikket og dermed netthinnen er helt og umiddelbart fjernet, er det hensiktsmessig valg av deprivasjon når målet er å irreversibelt fjerne både spontan og mønstret syn på en gang. Det induserer også en robust intraokulært aktivitet ubalanse som kan forbedre signal til støyforhold i aktivitet kartleggingsstudier 11,12. Sammenligning av funksjonelle og strukturelle endringer i respons til enucleation med those etter deprivasjon av mindre drastiske metoder som lokk sutur for eksempel, kan også utsette ny innsikt i rollen som spontan retinal aktivitet både homeostatiske og synaptiske typer plastisitet.
Enucleation utløser et tap av trofiske påvirkninger i direkte retinal mål. For eksempel er BDNF nivåer betydelig nedregulert i den laterale geniculate nucleus (LGN) og overlegen colliculus av voksne utskrapte rotter 13. Reaktive oksygenforbindelser, som fungerer som budbringermolekyler å megle strukturelle ombygging, ble også påvist i subkortikale strukturer i voksen rotte visuelle system 14. Videre microglial og astroglial aktivering tvers av ulike subkortikale visuelle målet strukturer i musen oppstå i en bestemt post-enucleation tidsramme på én uke 15.. Sammen optiske deafferentation resultater i ulike subkortikale svar på glial, strukturelle og molekylnivå. Til tross for disse subcorticaleffekter, betyr det ikke nødvendigvis implisere effekter ved kortikale nivå 16. Verdt å merke seg, kryss-modal kortikal plastisitet, inkludert modifikasjoner i andre sensoriske områder ved siden av styrking av ikke-visuelle input til fratatt visuell cortex oppstå etter både monocular (ME) 3,4,17,18 og kikkert (BE) 1,17 enucleation.
Bortsett fra å bidra til visuell nevro kan enucleation som en type deafferentation brukes til å studere forholdet mellom neurobeskyttende 19 og neurodegenerative 20-22 egenskaper av det sentrale nervesystemet.
Forskjellige fremgangsmåter til å utføre enucleation er allerede beskrevet i litteraturen. Enkelte metoder for in vivo ME hos rotter og mus er mindre grei grunn unødvendig seksjonering av orbital muskler og vev 23-25. Andre publikasjoner som Mahajan et al. (2011) 5 gir en detaljert protokoll ved hjelp stump disseksjon for en high-throughput samling av øynene for å studere genotype-fenotype korrelasjoner, trolig post-mortem. For sitt formål, er metoden enkel og rask. Imidlertid er denne fremgangsmåte lite egnet for in vivo enucleation når en velger å studere afferent visuell vei å følge enucleation (i levende dyr) i stedet for selve øyet. I en slik setting, er post-enucleation overlevelse av høy viktighet. Også minimal in vivo skader og bevaring av synsnerven og orbital vev er gunstig. Her presenterer vi en alternativ enucleation metode, mer lik den beskrevet av Faguet et al (2008) 26, som gir visse fordelaktige egenskaper:. Det er forbundet med en rask postoperative og er preget av en svært lav læringsterskel for forskere. Generelt, forskjellige metoder er komplementære, avhengig av fokus for senere forskning: eye morfologi eller visuell pathway forskning.
ve_content "> I sum kan enucleation brukes fra visjon forskningen mot undersøkelser av homeostatic og kryss-modal hjernens plastisitet, glial responsegenskaper, og axon stabilitet. I denne visualisert artikkelen, vi demonstrere en gjennomførbar og pålitelig metode for in vivo øye enucleation i musen.For å utføre en vellykket enucleation ifølge vår metode, de mest kritiske skritt for å vurdere er: 1) ved hjelp av en pinsett med buet og taggete spissen av passende størrelse; 2) som utfører enucleation på en glatt og tørr overflate; og 3) gradvis påskynde de sirkulære bevegelser i retning med den minste friksjon.
For en effektiv utfall er det viktig å bruke en passende tang preget av en buet og taggete tips (foretrukket spiss størrelse: mus: 0,5 x 0,4 mm, rotte: 2.15 x 1.3 mm). Krumningen gir en enkel tilgang til synsnerven etter øyeeplet fortrengning og er nødvendig for riktig håndplassering når du utfører de sirkulære bevegelser. Glatte tips anbefales ikke, fordi de mangler den nødvendige grep når du holder den optiske nerven. Unnlatelse av å holde den optiske nerven riktig under de sirkulære bevegelser resulterer i brudd av den oftalmiske arterie, dårlig løsgjøring av øyet og følgelig dårlig reproduserbarhet.Derfor anbefales det å første trening denne teknikken på avlives dyr for optimalisering av pinsett håndtering for å sikre maksimal dyrevelferd når bruk av metoden in vivo. Vellykket øye enucleation har nylig også blitt utført i rotte i vårt laboratorium ved bruk av den samme teknikk med unntak for dreining av dyrekroppen manuelt og holde den stasjonære tang.
En begrensning av teknikken er at det muligens kunne skade netthinnen. Derfor er denne fremgangsmåte er mindre egnet for oppsamling av netthinnene til å utføre 5 histologi. Dessuten er vår metode begrenset til å legge øynene åpne aldre siden øyeeplet må fortrenges fra stikkontakten uten å fjerne eller kutte øyelokkene.
Øyen enucleation i forskjellige arter, inkludert gnagere blir rutinemessig utført ved å bruke alternative metoder, som ofte innebære fjerning av øyelokkene og kutte den optiske nerven 18,23-25. Disse methods har en tendens til å være mer invasive og har en høyere lærekurve enn den teknikk som er beskrevet her. Uten behov for å fjerne eller sy øyelokkene, er innlegget kirurgi utvinning tid minimeres, noe som resulterer i høyere dyrevelferd og mer reproduserbare resultater.
The authors have nothing to disclose.
We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.
Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim Vetmedica | N/A | |
Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
Moria MC31 Forceps – Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Narrow Pattern Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products) |