Fra en 2DE-Gel Spot til Protein Funksjon: Lesson Learned From HS1 i kronisk lymfatisk leukemi
Summary
Her beskriver vi en protokoll som to par proteomic teknikker, nemlig 2-dimensjonal elektroforese (2DE) og massespektrometri (MS), for å identifisere differensielt uttrykt / post-translasjonelle modifiserte proteiner blant to eller flere grupper av foretrukne eksempler. Denne fremgangsmåten, sammen med funksjonelle forsøk tillater identifikasjon og karakterisering av prognostiske markører / terapeutiske mål.
Abstract
Identifikasjonen av molekylene som er involvert i tumor initiering og progresjon er grunnleggende for forståelsen sykdom biologi og, som en konsekvens, for den kliniske behandling av pasienter. I dette arbeidet vil vi beskrive en optimalisert proteomikk tilnærming for identifikasjon av molekyler som er involvert i utviklingen av kronisk lymfatisk leukemi (KLL). I detalj, er leukemic cellelysater løst ved 2-dimensjonal elektroforese (2DE) og visualiseres som "flekker" på 2DE gels. Sammenlignende analyse av proteomic baner tillater identifisering av differensielt uttrykte proteiner (i form av overflod og post-translasjonelle modifikasjoner) som er plukket, isolert og identifisert ved massespektrometri (MS). Den biologiske funksjon av de identifiserte kandidater kan testes ved forskjellige analyser (dvs. migrasjon, adhesjon og F-aktin polymerisasjonsbetingelser), som vi har optimalisert for primær leukemiske celler.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukemi (KLL), den vanligste voksen leukemi i de vestlige land, stammer fra opphopning av monoklonale neoplastiske CD5 + B-lymfocytter, og er klinisk svært heterogen. Det kan være til stede som en pre-leukemisk form, definert som B-celle-monoklonale lymphocytosis (MBL) 1,2,3. I andre tilfeller kan sykdommen vises enten med en lat klinisk forløp, som kan holde seg stabilt i mange år før de trenger behandling, eller som en progressiv chemorefractory sykdom med dystre prognose til tross for terapi. Endelig kan det utvikle seg til en ofte dødelig høy klasse lymfom (Richters syndrom-RS) 2,3,4. Pasientene er vanligvis klassifisert i to hoved undergrupper: god og dårlig prognose, basert på et sett av prognostiske faktorer som gir utfyllende informasjon om prediktorer for sykdoms utfall og overlevelse. Klinisk heterogenitet sannsynlig reflekterer biologisk heterogenitet. En rekke genetiske, microenvironmental og cellular faktorer har vist seg å samstemte til sykdom patogenesen om ingen samlende mekanismer har blitt funnet fem. I detalj, har flere studier vist at forskjeller i det kliniske forløpet av sykdommen kan delvis forklares ved nærværet (eller fraværet) av noen biologiske markører som har en prognostisk verdi 6,7,8. Disse data demonstrerte at en bedre forståelse av sykdommen biologi kunne gi ytterligere hint for den kliniske behandling av patologien, ved identifisering av både prognostiske markører og terapeutiske mål.
Målet med den foreliggende papir er å vise hvordan en kombinasjon av forskjellige proteomic teknikker kan benyttes for identifisering av proteiner involvert i CLL inntreden og utvikling. Vår tilnærming viser at det er mulig å delta sammen grunnleggende proteomikk og kliniske data fem.
I dagens arbeidsflyt, primære leukemic celler fra utvalgte pasienter(Vs god dårlig prognose) isoleres og cellelysater blir deretter anvendt for å oppnå proteomic kart. 2DE tillater karakterisering av proteomikk profilen av en cellepopulasjon, inkludert post-translasjonelle modifikasjoner, og dermed gi indirekte informasjon om den biologiske aktiviteten til hvert protein. Hele cellelysater blir løst ved en første dimensjon drevet basert på det isoelektriske punktet, etterfulgt av en andre dimensjon kjørt på en polyakrylamidgel som løser proteinene basert på deres molekylvekt. Sammenlignende analyse av proteomic baner tillater identifisering av differensielt uttrykte proteiner (både med hensyn til mengde og post-translasjonelle modifikasjoner) som flekker på gelen som kan kuttes og analysert ved massespektrometri. Rollen av hver kandidat kan deretter utnyttes av ulike analyser.
Denne tilnærmingen, begrenset til KLL i dagens manuskriptet, kan lett utvides til andre sykdommer / samples, og dermed gi informasjon om proteomic / biologiske forskjeller mellom to grupper (dvs. patologiske vs normal, stimulert vs unstimulated, vill-type vs knockdown).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hensikten med dette manuskriptet er å beskrive en optimal protokoll for identifisering av molekyler som er involvert i patogenesen av CLL, selv om denne metoden kan utvides til andre sykdommer og / eller andre prøvetyper 16-18. Ved å sammenligne de proteomikk profiler av to undergrupper av KLL pasienter, gode vs dårlig prognose 19, viste vi at de skiller seg i fosforylering status HS1 og at aktiveringen påvirker migrasjon og vedheft kapasitet på leukemic celler.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Lymfoid Maligniteter Unit, Elisa ti Hacken, Lydia Scarfo, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, og Angela Cattaneo.
Dette prosjektet ble støttet av: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro Airc (Investigator Grant og spesialprogram Molecular Clinical Oncology – 5 promille # 9965)
CS og BA designet studien, utført forsøkene, analysert dataene og skrev manuskriptet. MTSB, UR, FBPR assistert skriftlig manuskriptet. PG og FCC designet gir undersøkelsen pasientenes prøver og kliniske data.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
