Fra et 2DE-Gel Spot til Protein Funktion: Erfaringerne fra HS1 i kronisk lymfatisk leukæmi
Summary
Her beskriver vi en protokol, der kobler to proteomiske teknikker, nemlig 2-dimensional elektroforese (2DE) og massespektrometri (MS), til at identificere differentielt udtrykte / posttranslationelle modificerede proteiner blandt to eller flere grupper af delprøver. Denne fremgangsmåde, sammen med funktionelle eksperimenter, muliggør identifikation og karakterisering af prognostiske markører / terapeutiske mål.
Abstract
Identifikationen af molekyler, der er involveret i tumor initiering og progression er fundamental for forståelsen sygdom biologi og som følge heraf for den kliniske behandling af patienterne. I det foreliggende arbejde vil vi beskrive en optimeret proteomisk fremgangsmåde til identifikation af molekyler, der er involveret i progressionen af kronisk lymfatisk leukæmi (CLL). I detaljer er leukæmiske cellelysater løst ved 2-dimensional elektroforese (2DE) og visualiseret som "pletter" på 2DE geler. Sammenlignende analyse af proteom kort muliggør identifikation af differentielt udtrykte proteiner (i form af overflod og post-translationelle modifikationer), der er plukket, isoleret og identificeret ved massespektrometri (MS). Den biologiske funktion af de identificerede kandidater kan testes ved forskellige assays (dvs. migrering, adhæsion og F-actin-polymerisationsbetingelser), som vi har optimeret til primære leukæmiske celler.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL), den mest almindelige voksne leukæmi i de vestlige lande, stammer fra ophobning af monoklonale neoplastiske CD5- + B-lymfocytter og er klinisk meget heterogen. Det kan være til stede som en præ-leukæmisk form defineret som monoklonale B-celle lymfocytose (MBL) 1,2,3. I andre tilfælde kan sygdommen stå enten med en indolent klinisk forløb, der kan forblive stabilt i årevis, før brug for behandling, eller som en progressiv chemorefractory sygdom med dystre prognose trods behandling. Endelig kan det udvikle sig til en ofte dødelig høj kvalitet lymfom (Richters syndrom-RS) 2,3,4. Patienterne er normalt klassificeret i to undergrupper: gode og dårlige prognose, baseret på et sæt af prognostiske faktorer, der giver supplerende oplysninger om prædiktorer for sygdom prognose og overlevelse. Klinisk heterogenitet sandsynligvis afspejler biologiske heterogenitet. En række genetiske, microenvironmental og cellular faktorer har vist sig at tilslutte sygdom patogenese selv er blevet fundet 5 ingen samlende mekanismer. I detaljer, har flere undersøgelser vist, at forskelle i det kliniske forløb af sygdommen kan delvis forklares ved tilstedeværelsen (eller fraværet) af nogle biologiske markører, som har en prognostisk værdi 6,7,8. Disse data viste, at en bedre forståelse af sygdommen biologi kunne give yderligere hints til den kliniske behandling af patologi ved kortlægningen af både prognostiske markører og terapeutiske mål.
Målet med nærværende dokument er at vise, hvordan en kombination af forskellige proteomiske teknikker kan anvendes til identifikation af proteiner involveret i CLL debut og progression. Vores tilgang viser, at det er muligt at slutte sig sammen grundlæggende proteomisk og kliniske data 5.
I den nuværende arbejdsgang, primære leukæmiceller fra udvalgte patienter(God vs dårlig prognose) er isoleret og cellelysater derefter anvendes til opnåelse af proteom kort. 2DE tillader karakterisering af proteomisk profil af en cellepopulation, herunder post-translationelle modifikationer, hvilket giver en indirekte information om den biologiske aktivitet af hvert protein. Hele cellelysater klares ved en første dimension køre baseret på det isoelektriske punkt, efterfulgt af en anden dimension kørt på en polyacrylamidgel, der løser proteiner baseret på deres molekylvægt. Sammenlignende analyse af proteom kort muliggør identifikation af differentielt udtrykte proteiner (både med hensyn til tæthed og post-translationelle modifikationer) som pletter på gelen, der kan skæres og analyseres ved massespektrometri. Den rolle, som hver kandidat kan derefter udnyttes af forskellige assays.
Denne fremgangsmåde, som er begrænset til CLL i den nuværende manuskript, kan let udvides til andre sygdomme / prøver, hvilket giver information om proteomic / biologiske forskelle mellem to grupper (dvs. patologiske vs normal, stimuleret vs stimuleret, vildtype vs knockdown).
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med dette manuskript er at beskrive en optimeret protokol til identifikation af molekyler, der er involveret i patogenesen af CLL, også selv om denne fremgangsmåde kan udvides til andre sygdomme og / eller andre prøvetyper 16-18. Ved at sammenligne proteomik profiler af 2 undergrupper af CLL-patienter, god vs dårlig prognose 19, vi viste, at de adskiller sig i phosphorylering status HS1 og at dens aktivering påvirker migration og vedhæftning kapacitet leukæmiceller. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker lymfoide maligne sygdomme Unit, Elisa ti Häcken, Lydia Scarfo Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi og Angela Cattaneo.
Dette projekt blev støttet af: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant og Special Program Molekylær Klinisk Onkologi – 5 promille # 9965)
CS og BA designet undersøgelsen, udførte forsøgene, analyserede data og skrev manuskriptet. MTSB, UR, FBPR assisteret skriftligt manuskriptet. PG og FCC designet patienternes undersøgelse forudsat prøver og kliniske data.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
