Van een 2DE-Gel Spot aan Protein Functie: Lesson Learned From HS1 in Chronische Lymfatische Leukemie
Summary
Hier beschrijven we een protocol dat paren twee proteomics technieken, namelijk de 2-dimensionale elektroforese (2DE) en massaspectrometrie (MS), te identificeren differentieel tot expressie / post-translationeel gemodificeerde eiwitten tussen twee of meer groepen van primaire monsters. Deze aanpak, in combinatie met functionele experimenten, maakt de identificatie en karakterisering van prognostische markers / therapeutische doelen.
Abstract
De identificatie van moleculen betrokken bij tumor initiatie en progressie is fundamenteel voor de biologie inzicht ziekte en, bijgevolg voor de klinische behandeling van patiënten. In dit werk zullen we een geoptimaliseerde proteomics aanpak voor de identificatie van moleculen die betrokken zijn bij de progressie van chronische lymfatische leukemie (CLL) te beschrijven. In detail zijn leukemische cellysaten gescheiden door 2-dimensionale elektroforese (2DE) en gevisualiseerd als "spots" op de 2DE gels. Vergelijkende analyse van proteomics kaarten maakt de identificatie van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (in termen van overvloed en post-translationele modificaties) die worden geplukt, geïsoleerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). De biologische functie van de geïdentificeerde kandidaten worden getest door verschillende assays (bijvoorbeeld migratie, adhesie en F-actine polymerisatie), die we hebben geoptimaliseerd voor primaire leukemische cellen.
Introduction
Chronische Lymfatische Leukemie (CLL), de meest voorkomende leukemie bij volwassenen in de westerse landen, is afgeleid van de accumulatie van monoklonale neoplastische CD5 + B-lymfocyten en is klinisch zeer heterogeen. Het kan als een pre-leukemische vorm, gedefinieerd als monoklonale B-cel CLL (MBL) 1,2,3 zijn. In andere gevallen kan de ziekte voorkomen, ofwel met een indolent beloop, kan dat jarenlang stabiel blijven voordat behandeling nodig hebben, of als een progressieve chemorefractory ziekte met sombere prognose ondanks therapie. Ten slotte kan vooruitgang in een vaak dodelijke hooggradige lymfomen (Richter syndroom-RS) 2,3,4. Patiënten worden meestal ingedeeld in twee subgroepen: goede en slechte prognose, gebaseerd op een reeks van prognostische factoren die aanvullende informatie over voorspellers van de ziekte uitkomst en overleving biedt. Klinische heterogeniteit waarschijnlijk weerspiegelt biologische heterogeniteit. Een aantal genetische, micro-omgeving en cellular factoren is aangetoond dat eens aan pathogenese hoewel geen verenigende mechanismen gevonden 5. In detail hebben verscheidene studies aangetoond dat verschillen in het klinische verloop van de ziekte kan gedeeltelijk worden verklaard door de aanwezigheid (of afwezigheid) van bepaalde biologische markers die voorspellende waarde hebben 6,7,8. Deze gegevens toonden dat een beter begrip van de ziektebiologie extra aanwijzingen oplevert voor een klinische behandeling van de pathologie, de identificatie van zowel prognostische merkers en therapeutische doelwitten.
Het doel van dit papier aan hoe een combinatie van verschillende proteomische technieken kunnen worden gebruikt voor de identificatie van eiwitten betrokken bij CLL ontstaan en de progressie. Onze aanpak toont aan dat het mogelijk is om samen basic proteomische en klinische gegevens 5 sluiten.
In de huidige workflow, primaire leukemische cellen van geselecteerde patiënten(Good vs slechte prognose) geïsoleerd en cellysaten worden vervolgens gebruikt om proteoom kaarten verkrijgen. 2DE maakt de karakterisering van het proteomische profiel van een celpopulatie, waaronder post-translationele modificaties, waardoor indirect gegevens over de biologische activiteit van elk eiwit. Hele cellysaten worden opgelost door een eerste dimensie run gebaseerd op het isoelektrische punt, gevolgd door een tweede dimensie lopen op een polyacrylamidegel die eiwitten opgelost op basis van hun molecuulgewicht. Vergelijkende analyse van proteomics kaarten maakt de identificatie van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (zowel in overvloed en post-translationele modificaties) als vlekken op de gel af te snijden en door massaspectrometrie geanalyseerd. De rol van elke kandidaat kan vervolgens worden uitgebuit door verschillende assays.
Deze aanpak beperkt tot CLL in de huidige manuscript, kan gemakkelijk worden uitgebreid naar andere ziekten / samples, waardoor informatie verstrekken over het proteomic / biologische verschillen tussen de twee groepen (bijvoorbeeld pathologische versus normale gestimuleerde versus ongestimuleerde wildtype versus knockdown).
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit manuscript is een geoptimaliseerd protocol beschreven voor de identificatie van moleculen die betrokken zijn bij de pathogenese van CLL, zelfs indien deze benadering kan worden uitgebreid naar andere ziekten en / of andere soorten monsters 16-18. Door het vergelijken van het proteomische profiel van 2 subgroepen van CLL patiënten goed versus slechte prognose 19 hebben we aangetoond dat ze verschillen in de fosforylering status van HS1 en dat de activatie beïnvloedt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de lymfoïde maligniteiten Unit, Elisa ten Hacken, Lydia Scarfo, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, en Angela Cattaneo.
Dit project werd ondersteund door: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant en speciale programma Molecular Clinical Oncology – 5 promille # 9965)
CS en BA ontwierp de studie, voerde de experimenten, de data geanalyseerd en schreef het manuscript. MTSB, UR, FBPR geholpen bij het schrijven van het manuscript. PG en FCC ontworpen monsters van de studie verstrekt patiënten en klinische gegevens.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
