Mess räumliche und zeitliche Ca^{2 +} Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Summary

Ca2 ⁺ Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca ^{2 +-Signale} in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 ^{+-Indikatoren} Aequorin oder Case12.

Abstract

Entwicklungs-und Umweltreize auslösen Ca ^{2 +} Schwankungen in Pflanzenzellen. Reiz-spezifischen räumlichen-zeitlichen Ca ^{2 +} Muster werden durch zelluläre Ca2 ^+-bindende Proteine, die Ca ^{2 +-Signalkaskaden} initiieren abgetastet. Allerdings wissen wir noch wenig darüber, wie bestimmte Reiz Ca ^{2 +-Signale} erzeugt. Die Spezifität eines Ca ^{2 +-Signal} kann der ausgereiften Regulierung der Aktivitäten von Ca ^{2 +-Kanäle} und / oder Transporteure als Antwort auf einen gegebenen Reiz zurückzuführen. Diese Zellkomponenten zu identifizieren und ihre Funktionen zu verstehen, ist es wichtig, Systeme, die eine empfindliche und stabile Aufnahme der Ca2 ^+-Signale sowohl auf dem Gewebe und zellulärer Ebene zu ermöglichen verwenden. Genetisch kodierte Ca ^{2 +-Indikatoren,} die zu verschiedenen zellulären Kompartimenten richtet sind haben eine Plattform für Live Cell konfokale Bildgebung von zellulären Ca ^{2 +-Signale} zur Verfügung gestellt. Hier beschreiben wir Unterrichts für die Verwendung von zwei Erfassungssystemen Ca ^{2 +:} Aequorin basierend FAS (Klebefilm Sämlinge) Ca ^{2 +-Lumineszenz-Bildgebung} und case12 basierend Lebendzell konfokalen Fluoreszenz Ca ^{2 +-Bildgebung.} Lumineszenz-Bildgebung mit der FAS-System bietet eine einfache, robuste und sensitive Detektion der räumlichen und zeitlichen Ca ^{2 +-Signale} in der Gewebeebene, während Live Cell Imaging mit konfokalen Case12 bietet simultane Detektion von zytosolischen und Kern Ca ^{2 +-Signale} mit einer hohen Auflösung.

Introduction

Die Pflanzenzelle reagiert auf die Umgebung über die Signalisierungszelle Aktionen koordiniert. Ein frühes Zellsignalisierungsereignis als Reaktion auf Umweltreize ist eine vorübergehende Ca ^{2 +} zu erhöhen. Das Muster oder der Signatur einer transienten Zunahme der freien Ca ^{2 +-Konzentration} wird durch seine Amplitude, Frequenz und Dauer ist. Unterschiedliche Raum-Zeit-Ca ^{2 +-Signaturen} regulieren verschiedene Zellaktivitäten ^1. Spezifische Reize, wie Hitze, Kälte, Salz, Trockenheit, Licht oder Pflanzenhormone, kann eine Feinabstimmung des räumlichen und zeitlichen Aktivität des Membran-lokalisierten Ca ^{2 +-Kanäle} und / oder Transporteure, was in bestimmten Ca2 ^{+-Signaturen.} Obwohl Ca ^{2 +-Transporter} sind gut gekennzeichnet, ist nur wenig über die molekularen Identitäten und Funktionen der Ca2 ^+-Kanäle in Pflanzen ¹ bekannt. Genetische-Mutanten mit veränderten Ca ^{2 +} Reaktion auf Reize betonen, kann eine wirksame ca. seinoach für die Identifizierung der Komponenten, die Ca ^{2 +-Signaturen} zu komponieren. Kürzlich mehrere Aequorin basierend Ca ^{2 +} Detektionssysteme entwickelt, die genetischen Screens erleichtern für Ca2 ⁺ Signalkomponenten in Reaktion auf Krankheitserreger angreifen und abiotischen Stress ^2-4.

Äquorin wurde zuerst verwendet, um in den frühen 1990er Jahren ⁵ Ca ^{2 +-Signale} zu erkennen in Pflanzen. Seitdem hat Aequorin zu verschiedenen Zellkompartimenten wie dem Zytoplasma ^5, Kern ^{6, 7,} Chloroplasten, tonoplast ^{8, 9} Mitochondrien und Stroma ¹⁰ sowie an verschiedenen Zelltypen in der Stammzell spezifische Ca ² überwachen gezielt worden ⁺ Signale ^11. Äquorin basierend Ca ^{2 +-Messungen} zeigen, die räumliche und zeitliche Ca2 ⁺ Antwort einer Population von Zellen auf Reize zu betonen. In den meisten Fällen sind jedoch die Ca ^{2 +-Antworten} einzelner Zellen unsynchroniim antwort Gewebe ⁴ zed. Daher Aequorin Ca2 ⁺ Aufnahme nicht unbedingt die Ca ^{2 +-Signal} in einzelnen Zellen zu melden. In den letzten Jahren genetisch kodierte Fluoreszenzprotein (FP) basierenden Ca ^{2 +-Indikatoren,} wie gelb Cameleon (YCS) ¹² und ¹³ CASEs12 verwendet worden, um Ca ^{2 +} studieren Signalisierung mit hoher Auflösung subzellulärer. Ycs sind Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) basierenden Ca ^{2 +-Indikatoren,} CFP und YFP-Varianten enthalten, durch die Ca ^{2 +} gebunden bindende Protein Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Calmodulin eine Konformationsänderung wie sie Ca ^{2 +} bindet, wodurch bewirkt CFP und YFP näher zusammen, was zu einem erhöhten Energie-Transfer (FRET verstärkt). Die FRET-Level über die Zeit, in etwa dem Verhältnis der an GFP YFP Signalintensitäten berechnet, spiegelt die intrazelluläre Ca ^{2 +} Dynamik. YC mehrere Versionen in Pflanzen verwendet worden. YC3.6 war tin das Cytosol ^{14,15, 16} Kern, Mitochondrien ¹⁷ und ¹⁸ Plasmamembran und YC4.6 und D4ER argeted wurden in die Notaufnahme ^15,19 gezielte und D3cpv wurde den Peroxisomen ²⁰ ausgerichtet. Transgene Pflanzen, die YCS ermöglichen die Live-Cell-Imaging von Ca2 ⁺ Dynamik in verschiedenen zellulären Kompartimenten verschiedener Zelltypen. Fällen (vermutlich Ca lcium se nsor) sind Einzel zirkular permutierten fluoreszierende Proteine ​​(cpFPs) beherbergen eine Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Nach der Bindung an Ca ^{2 +,} Koffer unterziehen Konformationsänderungen, die zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Die Korrelation zwischen Fluoreszenzantwort der Fall und Ca ^{2 +-Konzentration} ermöglicht die intrazelluläre Ca2 ⁺ Dynamik quantitativ gemessen werden. Die Case12 Variante hat 12-fach erhöht Fluoreszenz in den Ca ^{2 +} -gesättigtem Formen. N. benthiminana Pflanzen vorübergehend ausdrEssing Case12 oder Arabidopsis-Pflanzen stabil exprimieren Fall 12 wurden verwendet, um Ca2 ^{+-Signalisierung} in der Verteidigung und abiotische Stress ^4,21 studieren. Asynchrone räumliche und zeitliche Ca2 ⁺ Oszillationen in Zellen, die auf Pathogenbefall oder Austrocknung Stress haben mit Case12 basierend Ca ^{2 +-Bildgebung} offenbart worden.

Hier präsentieren wir detaillierte Anweisungen für Aequorin Lumineszenz-Bildgebung von Gewebe-und Reize spezifischen Ca2 ⁺ Dynamik in Arabidopsis-Keimlinge, und für die konfokale Bildgebung von zytosolischen und Kern Ca ^{2 +} Dynamik in Arabidopsis Wurzelzellen, die Fall 12. Lumineszenz-Bildgebung von FAS äußern könnten, die den Stress-induzierten Ca2 ⁺ Dynamik in ganzen Pflanzen oder Gewebe hier nicht beschrieben zu analysieren oder mutagenisierten Arabidopsis Pflanzenpopulationen nach Mutanten mit veränderten Stress induziert Ca2 ^+-Signale zu screenen. Die Lebendzell Ca2 ⁺ Imaging-Setup könnte angepasst Ca analysieren2 + Dynamik innerhalb verschiedener subcelluar Kammern oder in verschiedenen Zelltypen mit anderen Ca ^{2 +-Indikatoren.}

Protocol

1. Aequorin Based Ca2 +-Imaging-System Mit der FAS Bereiten Pflanzgut für Lumineszenz-Bildgebung. Sterilisieren Samen von Arabidopsis-Pflanzen, Aequorin mit 10% Bleichlösung, die 0,01% Triton-100. Säen die Samen steril auf einer quadratischen Platte (10 x 10 cm im Quadrat Petrischale mit Gitter,) mit voller Kraft MS (Murashige und Skoog Basalsalzmischung), 1% Saccharose und 1,2% Agar. Ort Platten vertikal in einer Wachstumskammer nach einer Schichtung bei 4 ° C für 2 Tage (1A).</strong…

Representative Results

Mannit, NaCl und H 2 O 2 wurden als Stellvertreter für die Dehydratisierung, Salz und oxidativer Stress Stimuli verwendet wurden. Um zu überprüfen, ob die Schwermetallionen Cu 2 + Synergie mit jeder dieser drei Spannungsreize, verglichen wir die Ca2 + Antwort auf jeden Stimuli in Gegenwart oder Abwesenheit von Cu 2 +. Wie in 2 gezeigt, zeigte FAS Lumineszenzbildgebung dass Arabidoposis Sämlinge zu Dehydrierung, Salz und oxidativen Stress reagier…

Discussion

Wir haben ein FAS-System zur Aufzeichnung der räumlichen-zeitlichen Ca2 ⁺ Antwort von Arabidopsis Keimlingen nachgewiesen. Diese FAS Ca ^{2 +-Aufzeichnungssystem} ist eine einfache, empfindliche und stabile Ansatz zur Messung Ca2 ⁺ Dynamik durch verschiedene Stimuli neben den abiotischen Stressreize, die hier vorgestellt werden ausgelöst, angepasst werden kann. Mit diesem System können wir einfach vergleichen gewebespezifische Reize oder räumlich-zeitliche Dynamik Ca ^{2 +} in d…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG