RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord
Summary
This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.
Abstract
In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.
Introduction
Genetische Untersuchungen an lebenden Organismen verwenden häufig den Hühnerembryo als Modell, weil in ovo Elektroporation stellt eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, um embryonale Strukturen teilweise Transfektion in vivo mit DNA-Konstrukte 1-5. Bicistronische Expressionsvektoren, die ein Transkript, das ein fluoreszierendes Reporter zusammen mit dem Gen von Interesse, wie pCIG 6 oder Pmes 7 kodieren, ermöglichen eine schnelle Überprüfung der Transfektion Qualität in der gewünschten Region unter einem Stereomikroskop vor der Verarbeitung Embryonen für Downstream-Analyse.
Mit den jüngsten Fortschritten in der DNA-Sequenzierung ist es nun möglich, digitale gesamte Transkriptom Expressionsprofile von RNA-Proben unter Verwendung von RNA-Seq 8,9 erhalten. Statt also zeitaufwendige Verfahren, die Analyse von nur wenigen Genprodukte parallel ermöglichen, wie in situ Hybridisierung, Immunhistochemie und qPCR, Herstellung von cDNA-Bibliotheken fürHochdurchsatz-Sequenzierung kann Informationen des gesamten Transkriptoms. Beobachtung der experimentellen Effekte auf die Expression von jedem einzelnen Gens kann wiederum bieten leistungsstarke Einblicke in die Wege, durch das Konstrukt verwendet verändert. Dies ist besonders einfach, wenn eine genomische Anordnung für den verwendeten Organismus ist, wiederum ist damit der Hühnerembryo ein geeignetes Modell.
Wenn der Benutzer Zugang zu einer zuverlässigen Genomsequenzierung Zentrum hat, ist das Hauptproblem hoher Qualität zu erhalten RNA-Proben. Diese Arbeit zeigt, ein Verfahren zur Gewinnung von RNA Proben transfiziert Neuralrohren für RNA-Seq sowie den nachgeschalteten Schritten zur in silico Analyse der resultierenden Datensätze. Nach Elektroporation bei HH12-13 gefolgt von 48 h Inkubation wurden die transfizierten Stamm Rückenmarkshälften in Ribonuklease freien Bedingungen seziert sofort lysiert und weiteren Abbau durch ultra-niedrigem Gefrierpunkt geschützt, bis RNA-Reinigung und Bibliotheks preparatIonen.
Das Galaxy öffentlichen Server 10 bietet Zugriff auf kostenlose Ressourcen für die Analyse von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten. Die Menge an Speicherplatz für registrierte Benutzer angeboten wird, genug für kleine Versuchs wodurch die Notwendigkeit für die lokalen Computerinfrastruktur. RNA-Seq Datenanalyse umfasst Filterung, Ausrichtung und Quantifizierung / Vergleich der Genexpression. Obwohl es allgemeine Richtlinien für die RNA-Seq Datenanalyse, werden Filterparameter hängen weitgehend von der Qualität der Sequenzierungs und sollte nach Qualitätskontrollanalyse der Ausgangsdaten bestimmt werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um zu erhalten und vergleichen RNA-Seq Profile embryonalen Hühnerrückenmark in vivo transfiziert. Als repräsentative Ergebnis Vergleich der Datensätze von zwei unabhängigen Kontrollproben mit einem leeren Vektor transfiziert zeigte, daß das Verfahren ist reproduzierbar und sollten Identifizierung differentiell Expres ermöglichensed-Transkripte in experimentellen Proben. Daher Anwendung dieser Methode hat das Potential, die Anzahl von Entdeckungen nach einem einzigen Versuch stark erhöhen und somit eine große Menge von Daten für nachfolgende Untersuchungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieten wir Richtlinien zur Analyse Wirkungen nach der Elektroporation des Huhns Rückenmark. Obwohl Elektroporation von DNA-Vektoren wird häufiger verwendet, um ein Gen von Interesse überexprimieren, kann man auch Konstrukte dominant Negativen quimeric Proteine oder Vorstufen Codierung verwenden für siRNAs zur Genfunktion knock-down Bedingungen 19-21 erzeugen. In der Tat kann den Vergleich der Transkriptom Profile sowohl Verstärkungs- und Verlust der Funktionsanalyse resultierenden darauf hin G…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Indian ìnk | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| – 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 0.225 g CaCl2.2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| – 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| – ddH2O to 1 L | |||
| – Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| – 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 1.15 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| – ddH2O to 1 L and filter | |||
| – 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| – Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| – Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
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