Method Article

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב C. elegans

DOI:

10.3791/51959

⸱

December 3rd, 2014

 , 
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העור הבוגר של C. elegans הוא מודל ניתן למעקב למחקרים על תגובות פצע אפיתל, כולל סגירת פצע, היווצרות צלקות וחסינות מולדת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג elegans האפידרמיס וציפורן ליצור שכבת עור אך מתוחכמת פשוטה שיכול לתקן את הנזק מקומי כתוצאה מפציעתם. מחקרים של תגובות פצע ותיקון במודל זה מואר ההבנה של cytoskeletal ותגובות הגנומי לנזק לרקמות שלנו. שתי השיטות הנפוצות ביותר לפצע ג עור בוגר elegans הם דקירות במחטי microinjection, והקרנת לייזר מקומית. מחט פצעה מקומי משבשת את הציפורן, האפידרמיס, ומטריצת חוץ-תאית הקשורים, וגם עלול לגרום נזק לרקמות פנימיות. תוצאות קרינת לייזר בנזק יותר מקומי. פציעה מפעילה רצף של תגובות assayed בקלות כולל אפידרמיס הגבוה Ca 2 + (שניות-דקות), היווצרות וסגירת טבעת המכיל אקטין באתר הפצע (1-2 שעות), שעתוק מוגבר של גני פפטיד מיקרוביאלית (2-24 שעה), והיווצרות צלקת. בעיקרו של דבר את כל בעלי החיים המבוגרים הסוג בר לשרוד פציעה, שבוכמוטציות פגומות תיקון פצע או תגובות אחרות מראים ירידה בהישרדות. פרוטוקולים מפורטים למחט ופציעת לייזר, ומבחנים לכימות והדמיה של תגובות פצע ותהליכי תיקון (דינמיקת Ca, אקטין דינמיקה, אינדוקציה פפטיד מיקרוביאלית, והישרדות) מוצגים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מנגנוני ריפוי עור פצע הם עניין ביולוגי בסיסי ורלוונטיים לבריאות אדם. ריפוי פצעים בבעלי חוליות ויונקים כולל סדרה מורכבת של תגובות מתואמות של רקמות רבות ואיתות 1. אורגניזמים מודל גנטי פשוטים רבים הם גם מסוגלים ריפוי פצעי עור 2. לכן זה עניין לנתח מודלים גנטיים צייתנים של תיקון פצע עור. אנו ואחרים החלו להשתמש elegans Caenorhabditis כמודל חדש לפצע עור ריפוי 3,4. המטרה של פרוטוקול זה היא לאפשר למגוון רחב יותר של חוקרים להשתמש בג elegans ככלי לחקור מנגנונים מולקולריים ותאיים של ריפוי הפצע באפידרמיס.

ג עור

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים הבאים מתארים את הנוהל מפורט לג עור elegans פצע ולמנסה לאמוד את תגובות פצע.

1. מחט פציעת 3,4

  1. לגדול תולעי unstarved בריאים על NGM הסטנדרטי (מדיום גידול נמטודות) צלחות עם E. חיידקי coli OP50 כמזון, נשמרו בחממה C ° 20.
    הערה: שיטות לצלחות אגר NGM וטיפוח שיגרתי של ג ניתן למצוא elegans בשעה 6 www.wormbook.org.
  2. פיק 25 תולעי שלב L4 ליום ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לייזר או פציעת מחט יפעיל העלאה מהירה ומתמשכת ברמות Ca אפידרמיס, כמו דמיין עם חיישני Ca כגון GCaMPs (איור 1). העלאת Ca מתרחשת תוך שניות, ונשארה גבוה במשך עשרות דקות. מחט פצעה reproducibly תוצאות בהיווצרות של טבעות F- אקטין באתרי פצע (איור 2); אלה מופיעים בתוך דקות, ובהדרגה קרובים מעל 1-2 שעות לאחר פציעתם. טבעות אקטין פחות לעתים קרובות נוצרות לאחר פציעת לייזר מדויקת יותר. שתי פציעת המחט והלייזר לגרום לביטוי של פפטידים אפידרמיס מיקרוביאלית (אמפר) כגו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות שהוצגו כאן למחט ופציעת לייזר לספק גישות משלימות להערכת היכולת של האפיתל אפידרמיס לתקן את הנזק. פציעת לייזר היא יחסית מקומית ו( בהתאם לתצורת לייזר) יכול להיות מוגבל לאפידרמיס, ואילו פציעת מחט משבשת את האפידרמיס, ציפורן, וקרומים מרתף פנימיים סביר. פציעת מחט עשויה בצורה מדויקת יותר דומה לפצעים שנגרמו על ידי גורמי מחלה או פגיעה מכאנית בסביבה הטבעית. ככלל, פציעת מחט דורשת יותר תרגול כדי להשיג פצעים מדויקים התואמים את ההישרדות של בעלי חיים. התגובות התאיות לדמיון רב מחט ותצוגת פצי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מודעים לאינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות פציעת מחט עבור C. elegans פותחו לראשונה על ידי Nathalie Pujol ו-Jonathan Ewbank; אנו מודים ל-Nathalie Pujol על ההערות על כתב היד. העבודה במעבדה שלנו על תיקון פצעי אפידרמיס של C. elegans נתמכת על ידי מענק מה-NIH ל-A.D.C. (R01 GM054657).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseDenville ScientificCA3510-8
פלסטיק פטרי צלחתTritech ResearchT330860 מ"מ
LevamisoleSigmaL975612 מ"מ
בורוסיליקט זכוכית נימיWorld Precision Instruments1B100F-4
חולץ מחטSutter Instrument P-2000
פיק תולעים (חוט פלטינה)Tritech ResearchPT-9010
M9 תמיסתתוצרת3 גרם KH2PO4, 6 גרם Na2HPO4, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל 1 M MgSO4, H2O עד 1 ליטר. עיקור על ידי חיטוי
TrizolInvitrogen15596026השתמש ב-500 מ"ל ל-50 תולעים
iQ SYBR GreenBio-Rad1708882
SuperScript IIIInvitrogen18080-051
PCR מכונתBio-RadC1000/CFX96
צינורות PCR 96 בארותBio-RadMLL9601
תוכנת ניתוח תמונהמטמורפהשל התקנים מולקולריים
בית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
  2. Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans WoundingNeedle WoundingLaser IrradiationEpidermal CalciumActin Ring FormationAntimicrobial Peptide InductionWound Healing AssayConfocal MicroscopyFluorescent MarkersSurvival Quantification

Related Articles