एक तीन आयामी मैट्रिक्स कोलेजन के भीतर सेल प्रवास का विश्लेषण

Summary

सेल प्रवास ऐसी कैंसर जैसे घाव भरने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और pathophysiological प्रक्रियाओं, के रूप में, शारीरिक के ढेर में शामिल है कि एक जैविक घटना है. 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख एक 3 डी शारीरिक तरह के माहौल में भीतर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के प्रवासी गुणों का विश्लेषण करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है.

Abstract

विस्थापित करने की क्षमता विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की एक बानगी है और भ्रूण विकास, घाव भरने, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सहित कई शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. हालांकि, सेल प्रवास भी फैल मेटास्टैटिक शुरू करने के लिए प्राथमिक ट्यूमर से अलग करने के लिए इन कैंसर कोशिकाओं को सक्रिय करने के कैंसर में एक महत्वपूर्ण तंत्र है. पिछले कुछ वर्षों के भीतर विभिन्न सेल प्रवास assays के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है. कोशिकाओं की locomotory व्यवहार स्पष्ट रूप से एक दो आयामी (2 डी) के बीच अलग है और तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण यह एक 3 डी वातावरण के भीतर एम्बेडेड रहे हैं कि कोशिकाओं के प्रवास के विश्लेषण अधिक महत्वपूर्ण सेल प्रवास में उपज होता है कि माना जा सकता है क्योंकि डेटा. वर्णित 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख का लाभ कोशिकाओं बाह्य मैट्रिक्स के प्रमुख घटक का प्रतिनिधित्व कोलेजन फाइबर की एक शारीरिक 3D नेटवर्क के भीतर एम्बेडेड रहे हैं. के कारणसमय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी वास्तविक सेल प्रवास समर्थक प्रवासी कारकों या अवरोधकों के जवाब में कई माइग्रेशन मापदंडों के साथ ही उनके परिवर्तन के निर्धारण की अनुमति मापा जाता है. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं कोशिकाओं, और ट्यूमर कोशिकाओं, लिम्फोसाइटों / leukocytes सहित, इस तकनीक का उपयोग स्टेम विश्लेषण किया जा सकता है. इसी तरह, यह भी सेल समूहों या spheroids कोलेजन जाली में सेल क्लस्टर / अंडाकार आकृति से एकल कक्षों के उत्प्रवास के विश्लेषण के साथ मैट्रिक्स कोलेजन सहवर्ती भीतर एम्बेडेड जा सकता है. हम 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख एक मनोवैज्ञानिक की तरह 3 डी वातावरण के भीतर कोशिकाओं के पलायन का विश्लेषण करने के लिए एक बहुमुखी विधि है कि समाप्त.

Introduction

सेल संलयन (एक सिंहावलोकन के लिए ^1,2 देखें) सेल प्रवास भ्रूण विकास, घाव भरने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (समीक्षा के लिए ³ देखें) सहित शारीरिक प्रक्रियाओं के ढेर में शामिल है कि एक और जैविक घटना है की तरह. हालांकि, विस्थापित करने की क्षमता ट्यूमर कोशिकाओं (समीक्षा के लिए ^3,4 देखें) metastasize करने के लिए एक शर्त भी है.

सेल प्रवास, एक जटिल, विभिन्न ligand (जैसे, साइटोकिन्स, chemokines, वृद्धि कारक, हार्मोन, बाह्य मैट्रिक्स घटकों) रिसेप्टर (जैसे, रिसेप्टर tyrosine kinases द्वारा शुरू की कई संकेत पारगमन रास्ते के परस्पर क्रिया द्वारा निर्देशित है कि नहीं अभी तक पूरी तरह समझ प्रक्रिया है अंततः डे और फोकल आसंजन परिसरों की दुबारा जोड़ना और साथ actin cytoskeleton सहवर्ती के पुनर्गठन के कारण केमोकाइन रिसेप्टर्स, integrins) बातचीत ^{5 6} संकेत Integrin की मध्यस्थता.

<p clasएस = "jove_content"> इन विट्रो में कई और vivo सेल प्रवास assays में सेल प्रवास का विश्लेषण करने के लिए परख ^8-10, तीन आयामी (चिकित्सा Boyden कक्ष / transwell परख ^7, खरोंच परख / घाव सहित, पिछले दशकों में विकसित किया गया है 3 डी) मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख ¹¹ के साथ ही intravital इमेजिंग / माइक्रोस्कोपी (समीक्षा के लिए ¹² देखें). इन सेल प्रवास assays के प्रत्येक पेशेवरों और विपक्ष, जैसे, के विषय में लागत और उपकरणों की जरूरत है, से निपटने या प्राप्त आंकड़ों की विश्वसनीयता है.

Boyden कक्ष / transwell परख और खरोंच परख / घाव भरने परख दोनों विट्रो ^7-10 में सेल प्रवास को मापने के लिए आसान, कम लागत और अच्छी तरह से विकसित assays हैं. तथाकथित ऊपरी डिब्बे ⁷ – Boyden कक्ष में / transwell परख कोशिकाओं एक डालने वाले pores (लगभग 8 मीटर व्यास में) के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. वैकल्पिक, डालने कोशिकी मीटर के साथ लेपित किया जा सकता हैAtrix घटकों, जैसे, fibronectin, मज्जा, आदि, एक अधिक शारीरिक वातावरण नकल करने के लिए. इसी तरह, endothelial कोशिकाओं जिससे एक endothelial सेल बाधा ¹³ नकल उतार डालने के शीर्ष पर उगाया जा सकता है. ऐसे वृद्धि कारकों और chemokines के रूप में मीडिया और पूरक आहार, शरण कम डिब्बे में एक निर्धारित समय अंतराल के दौरान छिद्रों के माध्यम से पारित कर दिया है कि उन कोशिकाओं, सेल प्रवास (या तरल पदार्थ का स्त्राव) यों एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में उपयोग किया जाता है.

खरोंच परख में / घाव भरने परख कोशिकाओं प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और confluency ¹⁰ हो गई हैं. प्रयोगात्मक सेटिंग प्लेटों की निर्भरता में ऐसे फ़ाइब्रोनेक्टिन के रूप में बाह्य मैट्रिक्स घटकों के साथ पूर्व लेपित किया जा सकता है. खरोंच के प्रत्येक पक्ष से सेल monolayer एकल कक्षों scraping द्वारा घाव एक खरोंच / बनाने के बाद / घाव है, जिससे यह ¹⁰ चिकित्सा / भरने, खाई में माइग्रेट कर सकते हैं. खरोंच / घाव के दो पक्षों के बीच की दूरी निर्धारित किया जाता हैसमय की निर्भरता में और कोशिकाओं ¹⁰ के प्रवासी गतिविधि के लिए एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में प्रयोग किया जाता है. हालांकि, यह समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी और एकल कक्ष ¹⁰ पर नज़र रखने के साथ परख गठबंधन करने के लिए सिफारिश की है और सेल प्रवास (भी खरोंच / घाव के भरने / उपचार में परिणाम सकता है) सेल प्रसार के बीच विभेद करने के लिए.

हालांकि, Boyden कक्ष / transwell परख और परख चिकित्सा खरोंच परख / घाव दोनों, एक शारीरिक तरह सेलुलर पर्यावरण के विषय में नहीं बल्कि अपूर्ण हैं. Boyden कक्ष में / transwell परख कोशिकाओं खरोंच में परख कोशिकाओं चिकित्सा परख / घाव एक दो आयामी पूर्व लेपित प्लास्टिक प्लेट पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, जबकि एक प्लास्टिक ताकना के माध्यम से विस्थापित करने के लिए है. इसी तरह, यह अच्छी तरह से प्रवासी व्यवहार एक दो आयामी और 3 डी वातावरण के बीच ³ अलग किस्म कि मान्यता प्राप्त है. उदाहरण के लिए, fibroblasts की तीन आयामी मैट्रिक्स adhesions दो पर विशेषता फोकल और तंतुमय adhesions से अलगα5β1 और αvβ3 integrins, paxillin, अन्य cytoskeletal घटक है, और फोकल आसंजन kinase ¹⁴ के tyrosine फास्फारिलीकरण की उनकी सामग्री में -dimensional substrates. इसी तरह, एक 3 डी वातावरण के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं को भी एक बदल प्रवासी व्यवहार ¹⁵ का प्रदर्शन किया. इस प्रकार अधिक सही सेल प्रवास का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवास परख एक 3 डी शारीरिक या शारीरिक तरह पर्यावरण के भीतर एकल कक्षों के प्रवास को मापने के लिए अनुमति सिफारिश की है.

Intravital इमेजिंग / माइक्रोस्कोपी एक 3 डी शारीरिक संदर्भ में सेल प्रवास को मापने के लिए सोने का मानक है. यह केवल आज तक, की वजह से संभव हो सकता है, जो भी है लेकिन इस तरह के लिम्फ नोड ^17, भीतर तरल पदार्थ का स्त्राव ¹⁶ या लिम्फोसाइट तस्करी के दौरान ट्यूमर कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं के रूप में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत के लिए, बाह्य मैट्रिक्स सेल बातचीत से संबंधित नहीं है इस तरह के 2 फोटॉन के रूप में सुधार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक,लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग, फ्लोरोसेंट प्रोटीन डेरिवेटिव ^12,16,17 व्यक्त महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंगों और ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग. साथ ही, intravital इमेजिंग / माइक्रोस्कोपी मैनुअल और स्वचालित सेल ¹⁸ पर नज़र रखने के साथ जोड़ा जा सकता है. हालांकि, क्योंकि एक 2 फोटॉन लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग की जरूरत है और साथ ही जानवरों (और उपयुक्त ट्रांसजेनिक पशु मॉडल) के intravital इमेजिंग / माइक्रोस्कोपी एक नहीं बल्कि लागत गहन तकनीक है.

Boyden कक्ष / transwell परख और खरोंच परख / घाव भरने परख की सीमाओं को पार करने के लिए और 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख ^11,19 विकसित किया गया था एक 3 डी वातावरण में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के पलायन का विश्लेषण करने के लिए. इस प्रकार, पलायन कोशिकाओं एक 3 डी कोलेजन फाइबर नेटवर्क, जो इन विवो को अधिक जैसा दिखता स्थिति के भीतर एम्बेडेड रहे हैं. एकसाथ, समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी वास्तविक सेल प्रवास के कारण determi की अनुमति मापा जाता हैकई माइग्रेशन मापदंडों के साथ ही समर्थक प्रवासी कारकों या अवरोधकों के जवाब में उनके परिवर्तन की राष्ट्र. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं लिम्फोसाइटों और leukocytes ^11,20, hematopoietic स्टेम / ^21-24 पूर्वज कोशिकाओं, और ट्यूमर कोशिकाओं ^5,25-29 सहित इस तकनीक का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया जा सकता है. एकल कक्षों के अलावा भी समूहों सेल या spheroids ^30,31 जाली कोलेजन में सेल क्लस्टर / अंडाकार आकृति से एकल कक्षों के उत्प्रवास के विश्लेषण के साथ मैट्रिक्स कोलेजन सहवर्ती भीतर एम्बेडेड जा सकता है.

इन विवो स्थिति के करीब हैं कि परिणाम में उपज इन विट्रो विधि – इस प्रोटोकॉल एक 3 डी वातावरण में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक सरल, लेकिन शक्तिशाली तकनीक के बारे में एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करता है.

Protocol

प्रवासन मंडलों की 1. तैयारी मिश्रण जब तक मिश्रण और गर्मी से पिघल गया: एक पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली (1 1) तैयार करें. एक पेंट ब्रश का प्रयोग और पैराफिन मोम / पेट्रोलियम जेली के 2-3 परतों आकर्षित (1: 1) आंक…

Representative Results

समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी और कंप्यूटर की मदद से सेल ट्रैकिंग के साथ संयुक्त इस्तेमाल किया 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन प्रवास परख दोनों जनसंख्या आधारित पैरामीटर (जैसे, locomotory गतिविधि मतलब है) सहित विभिन?…

Discussion

विस्थापित करने की क्षमता ट्यूमर कोशिकाओं ⁴ की एक बानगी है. प्राथमिक ट्यूमर से अलग करने के लिए और लगभग सभी कैंसर रोगियों की मृत्यु के मुख्य कारण हैं जो माध्यमिक घावों, बीज के लिए सक्षम नहीं होगा आसपा?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petrolatum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% Sodium Bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use