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Immunology and Infection

एक सेल आधारित एलिसा परख का उपयोग एचआईवी -1 trimeric लिफाफा glycoproteins के गठनात्मक मूल्यांकन

Published: September 14, 2014
doi:
10.3791/51995
, , , , , ,
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology,Université de Montréal

Summary

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Abstract

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Introduction

Trimeric वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (पर्यावरण) द्वारा मध्यस्थता मानव इम्यूनो वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) प्रविष्टि, संक्रामक चक्र का पहला कदम है. Virions की सतह पर प्रस्तुत केवल उजागर वायरल प्रतिजन होने के नाते, पर्यावरण trimer निष्क्रिय और nonneutralizing एंटीबॉडी elicits. जैसे, यह टीका immunogen डिजाइन के लिए एक दिलचस्प उम्मीदवार का प्रतिनिधित्व करता है. हालांकि, घुलनशील या पुनः संयोजक रूपों में पर्यावरण के साथ टीकाकरण परीक्षणों प्राथमिक एचआईवी -1 1-3 आइसोलेट्स सबसे खिलाफ केवल न्यूनतम प्रभाव के साथ प्रतिक्रियाओं हासिल. बहरहाल, आंशिक प्रभावकारिता एक immunogen उम्मीदवार के रूप में एचआईवी -1 लि में RV144 टीका परीक्षण 4 नए सिरे से ब्याज में मनाया. इस टीके हासिल विरोधी लि एंटीबॉडी SIV के खिलाफ संरक्षण की एक निश्चित डिग्री उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त थे और एचआईवी 5 कि चुनौतियों का वर्णन हाल के एक अध्ययन से पुष्टि की गई थी.

Endoplasmic जालिका में संश्लेषित किया जा रहा है, पर्यावरण glycoprote बादअग्रदूत, gp160 में, वायरल संलयन की प्रक्रिया को ईंधन की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं कि विभिन्न बाद translational संशोधनों आए. लि अग्रदूत gp120-gp41 संपर्क बनाए रखने noncovalent बातचीत के साथ, अपनी अतिरिक्त cytoplasmic gp120 और transmembrane gp41 सब यूनिटों 6-10 में cleaved किए जाने से पहले trimers में ठीक से और सहयोगी गुना चाहिए. संक्रमित कोशिका मशीनरी भी भारी इसकी कुल द्रव्यमान 11,12 के बारे में 50%, जिसमें पर्यावरण glycosylating के लिए जिम्मेदार है. बेहतर विभिन्न रचना को समझने के महत्व पर प्रकाश डाला, पर्यावरण के अनुकूल है और नहीं तो 15-19 उजागर किया जाएगा कि कुछ अत्यधिक immunogenic epitopes छिपाने के लिए अनुमति देने के लिए सोचा है कि एक metastability प्रदान करते हुए जिसके परिणामस्वरूप जटिल संरचना, पर्यावरण 13,14 conformationally लचीला होना करने की अनुमति देता देशी लि trimer से जांचा.

तिथि करने के लिए, कई तकनीक विकसित की है और सफलतापूर्वक लि गठनात्मक चर्चा अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैAnges. हालांकि, वे अक्सर विशिष्ट पर्यावरण संदर्भों के लिए प्रतिबंधित किया जा रहा है, अपनी सीमाओं में भिन्नता है. उदाहरण के लिए, सतह plasmon अनुनाद या रचना विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग immunoprecipitation assays (MABS), या तो उनके trimeric रूपों 20,21 से immunogenetically अलग हो जाना जाता है जो मोनोमेरिक घुलनशील या solubilized लि अणुओं पर भरोसा करते हैं. हाल के अध्ययनों से भी दरार मुख्य रूप से एंटीबॉडी 14,22,23 nonneutralizing द्वारा मान्यता प्राप्त epitopes के जोखिम में जिसके परिणामस्वरूप पर्यावरण रचना को प्रभावित करता है कि सुझाव है.

यहाँ हम विस्तार से cellularly व्यक्त लि trimers 18,24-26 की रचना की तेज और आसान निर्धारण के लिए अनुमति देता है कि एक विधि का वर्णन. एक मानव पक्षपाती सेल लाइन में पर्यावरण के क्षणिक अभिकर्मक के बाद पर्यावरण विशिष्ट एंटीबॉडी के बंधन एक सरल chemiluminescence प्रतिक्रिया का उपयोग का पता चला है. इस तकनीक को भी की गठनात्मक वरीयता चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता रचना-निर्भरतासेंध एंटीबॉडी. इस प्रकार, इस परख एक मजबूत और अत्यधिक लचीला पहचान पद्धति प्रदान करता है.

Protocol

1 दिन 1 – सेल संस्कृति प्लेट 2 एक्स 10 4 मानव ऑस्टियो सार्कोमा (अस्पताल) luminescence पढ़ने के लिए उपयुक्त एक अपारदर्शी, 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं. 10% भ्रूण गोजातीय सीर?…

Representative Results

ऊपर वर्णित सामान्य प्रक्रिया का उपयोग करना, हम जंगली प्रकार (WT) या उत्परिवर्तित लि या तो पर CD4i epitopes के जोखिम पर घुलनशील सीडी 4 (sCD4) और coexpressed सेलुलर सीडी 4 के प्रभाव परख के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित, 18,24 पहले वर्ण…

Discussion

इस परख एचआईवी -1 trimeric पर्यावरण कोशिका की सतह पर व्यक्त के साथ विशिष्ट Mabs की बातचीत का पता लगाने के लिए अनुकूलित है. प्रोटोकॉल स्थापित हो जाने के बाद, यह कम समग्र माल की लागत और एंटीबॉडी के छोटे मात्रा के साथ ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम अपने उदार A32, 17B, 48d का उपहार, और C11 Mabs के लिए डॉ जेम्स रॉबिन्सन धन्यवाद. PGT 121 एनआईएच एड्स अभिकर्मक कार्यक्रम, एड्स, NIAID, एनआईएच (बिल्ली # 12343) के डिवीजन के माध्यम से प्राप्त हुई थी. इस काम के वैज्ञानिक वायुसेना के लिए और एक CRCHUM सातत्य अनुदान के रूप में भी एक CIHR उत्प्रेरक अनुदान # 126630 द्वारा # 24639 अनुदान यंग की एक FRQS स्थापना करके, एक CIHR ऑपरेटिंग # 257792 द्वारा, अभिनव कार्यक्रम नेता # 29866 के लिए एक कनाडा फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया वायुसेना और श्री. वायुसेना एक FRSQ Chercheur BOURSIER जूनियर 1 फैलोशिप # 24639 के प्राप्तकर्ता है. एमवी एक CIHR डॉक्टरल अनुसंधान पुरस्कार # 291485 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
HOS cells ATCC CRL-1543
White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom BD 353296
Polyethylenimine, linear, 25000 MW Polysciences 23966 Prepared in 1mg/ml solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11995
Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated Pierce 31413
Enhanced Chemiluminescence Substrate PerkinElmer NEL105001EA
TriStar LB 941, Plate Reader Berthold Technologies
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References

  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

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Veillette, M., Coutu, M., Richard, J., Batraville, L., Désormeaux, A., Roger, M., Finzi, A. Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay. J. Vis. Exp. (91), e51995, doi:10.3791/51995 (2014).
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