Формирование Анализ Soft Агар колонии
Summary
The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.
Abstract
Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.
Introduction
Мягком агаре образование колоний анализ представляет собой метод широко используется для оценки клеточной трансформации в пробирке. Исторически сложилось так, другой тест, клоногенности, описывается шайба и др. В 1956 г. был использован для оценки способности клеток образовывать колонии 1. В этой технике, клетки были рассеяны на культуральную чашку и выращивают в присутствии '' фидерных клеток или кондиционированной среды, чтобы обеспечить необходимые ростовые факторы. Ограничение этого способа в том, что это только при условии, информацию в отношении образования колоний. Нормальные клетки не имеют возможности крепления-независимого роста, из-за того или иного вида апоптоза, называемой anoikis 2. Тем не менее, трансформированные клетки обладают способностью расти и делиться без привязки к подложке. Чтобы извлечь выгоду из этой концепции, исследователи разработали программную агар анализа формирования колонии. Мягком агаре анализ образование колоний с тех пор были изменены, в последние годы, для решения Specific потребности. Один из вариантов включает включение флуорометрического красителем, чтобы позволить для подсчета колоний высокой пропускной. Еще один вариант предполагает использование специализированного раствора агара, чтобы обеспечить извлечение жизнеспособных клеток после образования колоний, когда белок или ДНК пробы нужны.
В традиционном мягком агаре колонии анализа пласта, клетки выращивают в слое мягком агаре, смешанного с клеточной культуральной среде, которая лежит на другом слое мягком агаре, также в смеси с клеточной культуральной среды, но содержащий более высокую концентрацию агара. Это предотвращает клетки от присоединения к культурального планшета, пока позволяет трансформированные клетки образуют видимые колонии. Смысл этого метода является то, что нормальные клетки зависит от клетки к внеклеточной матрицы контакте, чтобы иметь возможность расти и делиться. И наоборот, трансформированные клетки обладают способностью к росту и делению, независимо от окружающей их среды. Таким образом, клетки, способные образовывать колонии в опоре-независимым способом были Considered должны быть преобразованы и канцерогенными. Общая цель этого метода заключается в измерении эту возможность в клетках в полу-количественного и строгой манере.
Сигнальный путь Wnt является критическим в эмбриогенезе и часто де-регулируется в онкогенеза 3-6. Есть несколько путей, связанные с Wnt сигнализации. Канонический путь включает Wnt сигнализацию и регулирование вниз по течению транскрипции генов через его влияние на транскрипционный коактиватора бета-катенина. Wnts также сигнализировать через несколько неканонические путей, например, плоской клеточной полярности путь, который регулирует элементы, участвующие в структуре цитоскелета 7, и путь Wnt-кальция, который регулирует высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума 8. Wnt лигандов проявляют свою активность посредством связывания Frizzled рецепторы. Хотя несколько Wnts, как было показано, чтобы быть активируется при раке легкого, Wnt7a было показано, что подавляется в не-Smalрак легких л клеток через метилирования промоторов 9. Wnt7a связывает Fzd9 и действует как подавитель опухоли через неканонической пути. Восстановление Wnt-7а и FZD-9 подавляет рост немелкоклеточного рака легкого ячеек 10. Эффекты Wnt7a / Fzd9 опосредованы активацией ERK-5, который, в свою очередь, активирует пероксисом γ-рецептора активатора пролиферации (PPAR, 11,12). Здесь мы показываем, что избыточная экспрессия Wnt7a и Fzd9 приводит к подавлению крепления независимый рост мышиной линии карциномы легкого клеток. Мышиные CMT167 клетки были получены из карциномы легких у C57BL мышей / 13 КЗоТ и были стабильно трансфицированные Wnt7a и Fzd9. Сверхэкспрессия Wnt7a и Fzd9 были подтверждены количественного-ПЦР (Q-PCR) и функциональности Wnt7a и Fzd9 гиперэкспрессией было подтверждено через потоку активации PPAR,.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экстракорпоральное подтверждения опухоли подавляющих функцию сигнальных белков трудно. Один из самых строгих анализов, доступных для расследования этого имущества является мягкий агар анализ образования колоний. Здесь мы проиллюстрировали мягкий агар анализа формирования кол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a Merit Award from the U.S. Department of Veterans Affairs, and an NIH grant R01CA1385282522717 to RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2X cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1X cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% Agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2X cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2X medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 degree C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15mL Conical Tubes | |||
| 50mL Conical Tubes | |||
| 250mL Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5mL Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
- Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
- Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
- De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
- Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
- Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
- Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
