Måle Lokale anafylaksi i Mus

Summary

Allergiske reaksjoner, karakterisert ved at aktivering av mastceller og basofiler, er drevet av kryssbinding av IgE og frigjøring av proinflammatoriske mediatorer. En kvantitativ vurdering av allergiske reaksjoner som kan oppnås ved hjelp av Evans Blue fargestoff for å overvåke forandringer i vaskulær permeabilitet etter allergen-angrepet.

Abstract

Allergiske responser er et resultat av aktiveringen av mastceller og basofiler, og den etterfølgende frigjøring av vasoaktive og proinflammatoriske mediatorer. Eksponering for et allergen i et lysfølsomt individ kan føre til kliniske symptomer som varierer fra mindre erytem til livstruende anafylaksi. I laboratoriet har forskjellige dyremodeller blitt utviklet for å forstå mekanismene ikke allergiske reaksjoner. Heri beskrives en detaljert fremgangsmåte for å måle forandringer i vaskulær permeabilitet for å kvantifisere lokaliserte allergiske responser. Den lokale anafylaksi analysen ble først rapportert i 1920, og har blitt tilpasset fra teknikken utgitt av Kojima et al. i 2007 ^1. I denne analysen, er mus sensibilisert for OVA utfordret i venstre øre med kjøretøy og i høyre øre med OVA. Dette er etterfulgt av en intravenøs injeksjon av Evans Blue fargestoff. Ti minutter etter injeksjon av Evans blått, er dyret avlivet og fargestoff som har ekstravasert itil ørene er hentet over natten i formamide. Absorbansen av det ekstraherte fargestoff ble deretter kvantifisert med et spektrofotometer. Denne fremgangsmåte resulterer i en pålitelig visuell og kvantifiserbar manifestasjon av en lokal allergisk reaksjon.

Introduction

Type I hypersensitivitet er mediert av antigen-indusert tverrbinding av IgE på overflaten av mastceller og basofiler. Dette resulterer i cellulær degranulering og frigjøring av vasoaktive og proinflammatoriske mediatorer slik som histamin, tryptase, og blodplate-aktiverende faktor ^2. Etter utgivelsen av preformede mediatorer under degranulering, mastceller syntetisere og frigjøre prostaglandiner og leukotriener, noe som ytterligere øker vaskulær permeabilitet ^3. Den innledende kliniske respons skjer raskt og er referert til som en "umiddelbar reaksjon". I huden, er en wheal-og-bluss respons lett synlig bare minutter etter antigen utfordring. Avhengig av dosen av utfordringen, er det mulig å observere en "sen fase respons" noen få timer senere. Senfase hevelse skyldes lokalisert ødem og leukocytt rekruttering inn i vev ^to. Histamin, generelt ansett for å være den viktigste megler å ta del iumiddelbare allergiske reaksjoner, virker på histamin reseptor 1 (HR1) uttrykt på skip og histamin reseptor 2 (HR2) uttrykt på glatt muskulatur. Den kombinerte effekten øker blodgjennomstrømningen og vaskulær permeabilitet på stedet av betennelse ^fire.

En rekke dyremodeller av allergi har blitt utviklet for å studere mekanismene som er involvert i allergisk inflammasjon, inkludert modeller av allergisk astma, systemisk anafylaksi, og lokale anafylaksi. Intravenøs dye-administrasjonen har blitt brukt til å måle lokaliserte allergiske reaksjoner i dyremodeller for nesten et århundre, med publikasjoner som beskriver denne teknikken kan dateres tilbake til 1920-tallet ^fem. Kaniner og marsvin var de første dyremodeller brukes til å teste umiddelbare overfølsomhetsreaksjoner, og de ​​mest sensitive responser ble generelt funnet i øret ^5,6. Analysen ble senere godkjent til bruk i rotter og mus ^{7 8.}

Historisken rekke eksperimentelle metoder har vært brukt, inklusive injeksjon av antigen før injeksjon av fargestoff, injeksjon av fargestoff før injeksjon av antigen, og samtidig injeksjon av fargestoff og antigen. Intravenøs administrering fargestoff som et middel for måling av allergiske reaksjoner er en allsidig assay som kan brukes for måling av aktiv og passiv, og omvendt passive reaksjoner ^5,9. Mange fargestoffer har blitt benyttet for å vurdere allergiske reaksjoner, inkludert Trypan Blå, Pontamine Sky Blue, Evans Blue, Geigy Blå 536, og India Ink ^5,6,9. En oppløsning av 0,5% Evans Blue er for tiden standard fargestoff som brukes for måling av allergiske reaksjoner i huden.

Den anafylaktisk reaksjon på utfordringen er forbigående; maksimal intensitet er nådd i løpet av 10 – 15 min for fargestoff-injeksjon, og ingen reaksjon er synlig hvis fargestoffet blir administrert mer enn 30 minutter etter utfordring, uavhengig av de dyrearter som brukes ^ni. Kvantifisering av fargestoff bloduttredelse var opprinneligly erholdt ved å måle hevelses størrelse som angis av det blå fargestoff ^7-9. I tillegg kan tellinger av degranulated mastceller kvantifiseres ved excising huden vev fra stedet til reaksjonen og farging med toluidinblått ^7. Degranulering av mastceller blir ofte brukt som en markør for kutan, IgE-medierte allergiske reaksjoner, som mastceller er den viktigste lokale cellepopulasjon som uttrykker høyaffinitets IgE reseptor FcεRI. Spektrofotometriske teknikker for måling fargestoff bloduttredelse i vevet ble utviklet for passive kutane anafylaksi (PCA) hos rotter ¹⁰ og mus ¹¹ på 1990-tallet.

Den følgende lokale anafylaksi analyseprotokollen ble tilpasset fra Kojima et al. ^1, og utnytter kyllingegg ovalbumin (OVA) som antigenet for å fremkalle allergiske reaksjoner. Imidlertid kan andre enn OVA-antigenene kan brukes om ønsket. Analysen bruker deretter Evans Blue fargestoff å overvåke endringer i vaskulær permeability som oppstår på grunn av mastcelle IgE kryssbinding og histaminfrigjøring.

Protocol

1. bevisst Mus Tilbered en OVA stamløsningen ved å fortynne OVA i 1x PBS til en sluttkonsentrasjon på 20 mg / ml. Fryse ned porsjoner i cryovials og oppbevar ved -80 ° C for senere bruk. Ta en eller flere aliquoter av 20 mg / ml lager OVA til romtemperatur. Fortynn OVA i 1x PBS til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml i en 5 ml rundbunnet polystyren røret med et lokk. Vortex kort for å blande. Ved å holde i polystyren røret som inneholder 1 mg / ml OVA på en vortex innstilt på mid…

Representative Results

Dyr som har gjennomgått analysen vellykket vil ha hud og øyne som vises blå. PBS sensibiliserte dyr bør ikke reagere på enten PBS eller OVA utfordring, derfor begge ørene bør være i hvit (figur 1A). I OVA sensibiliserte dyr, øret mottar PBS utfordring (venstre) bør være enten helt hvitt eller svakt blå i et lokalisert måte på injeksjonsstedet. Øret mottar OVA utfordring (til høyre) skal bli gradvis mørkere blå i løpet av 10 min etter fargestoff administrasjon (figur 1B).</stro…

Discussion

Mange markører for allergisk sykdom brukes til å vurdere styrken av allergiske reaksjoner etter allergen utfordring, herunder endringer i nivåer av sirkulerende histamin, Th2 cytokin produksjon, og celle rekruttering til bronchoalveolar væske i innstillingen av luftveis utfordring. Mens overvåking endringer i disse parametrene er viktig for å studere allergiske reaksjoner, ikke biologiske markører ikke alltid korrelerer med klinisk allergisk sykdom. Den lokale anafylaksi analysen beskrevet i denne protokollen gir…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31G needle	Terumo	NDC 100861
27G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform