Создание Анатомически точного и воспроизводимого внутричерепного Ксенотрансплантаты человека опухолей головного мозга
Summary
Мозг представляет собой уникальное место с качествами, которые не очень хорошо, представленных в пробирке или внематочной анализов. Ортотопическая мышиные модели с воспроизводимыми местоположения и роста характеристик может быть надежно создан с внутричерепных инъекций с использованием стереотаксической фиксации инструмента и шприцевой насос низкого давления.
Abstract
Ортотопическая моделях опухолей в настоящее время лучший способ изучить характеристики типа опухоли, с и без вмешательства, в контексте живого животного – особенно в местах с уникальными физиологическими и архитектурных качеств, таких как мозг в пробирке и внематочная модели не могу. приходится функций, таких как сосудистой, гематоэнцефалический барьер, обмена веществ, доставки лекарств и токсичности, и множество других факторов. Ортотопическая модели тоже есть свои ограничения, но при надлежащем опухолевые техника клетки интерес может быть точно привиты в ткани, которые наиболее близко имитирует условия в человеческом мозге. Используя методы, которые обеспечивают очень точно отмеренные объемы точно определены места с постоянной скоростью и давлением, мышиных моделях опухолей головного мозга человека с предсказуемыми темпами роста может быть воспроизводимо созданной и подходят для надежного анализа различных мероприятий. Протокол, описанный здесь фокусируется на тэchnical детали проектирования и подготовки к внутричерепной инъекции, выполняя операцию, и обеспечение успешной и воспроизводимый рост опухоли и обеспечивает отправные точки для различных условий, которые могут быть настроены для целого ряда различных моделях опухолей головного мозга.
Introduction
В пробирке исследования мозговых клеток опухоли имеют неоценимое значение для рассечения молекулярные механизмы, стимулирующие рост, выживание, миграцию и инвазию раковых клеток; культивированный эксперименты клеток могут определить сигнальные пути, предложить потенциальные терапевтические мишени, и охарактеризовать клеточный ответ к лечению наркозависимости. Но в пробирке системы слишком упрощенным предсказать организменном ответ на фармацевтических препаратов; они не имеют физиологические реакции, иммунные реакции, сотовый микросреду и общую неоднородность живых систем животных. Генно-инженерные модели могут иметь неоценимое значение, если таковой имеется, но существуют молекулярные различия между видами и мышиных клеток не может резюмировать события в человека процессов, что приводит к значительным расхождениям при сравнении моделей животных с клиническими наблюдениями 1. Мышиные модели ксенотрансплантата, включающие подкожного (SQ) инъекции опухолевых линий клеток головного мозга человека под кожу фланг легко выполнитьи измерения; они могут быть использованы для решения последствий генной модификации и медикаментов / доставки, обмена веществ и токсичности. Значительные недостатки, однако, ограничить полезность моделей SQ. Микросреда не резюмировать, что из природной опухоли головного мозга: взаимодействия различных типов клеток и тканей; местный сосудистую, и множество других факторов уникальным для мозга не могут быть воспроизведены. Чтобы более точно воспроизвести уникальную среду из природной опухоли головного мозга и проверить эффекты фармацевтических мер, мыши ортотопическая модель следует использовать. Кроме того, ортотопической способы могут быть использованы как часть генной инженерии подхода, в котором первичные не-раковых клеток человека (дифференцированного или клетки-предшественники) являются генетически модифицированными и вводят в соответствующем месте мыши, с или без стромальных клетках человека, в результате чего опухолей аналогично тому, которое наблюдалось в организме человека 1.
В этой статье описываетсяМетодология точно и воспроизводимо создавать опухолей головного мозга у мышей. Используя эту технику, пользователь может точно вводить Небольшую аликвоту клеток, взвешенных в указанное место в лобно-теменно-височной области коры головного мозга мыши. Смертность мышей крайне низка; в наших руках, не мыши не умерли от хирургических осложнений после 185 процедур. Характеристики полученного опухоли можно сравнить с тем из типичных клинических опухолей человека; Например: скоростью роста, степень некроза, степени инвазии, неоднородностью типа клеток, наличие митотических клеток, маркеры пролиферации и апоптоза, и т.д. клеточных линий или с разбивкой ткани или образцы опухолевых человека может быть оценена на основе их способности моделировать реальную клиническую картину. Фармацевтика, выбирается на основе их деятельности в культуре клеток, могут быть проверены в контексте функционирующей метаболизма, сердечно-сосудистой системы, и гематоэнцефалический барьер, как они существуют в животной обременены остроумияха опухоли, все в соответствующем архитектурном контексте. Кроме того, клетки, выбранные для инъекций могут быть генетически модифицированы с целью изучения воздействия конкретных нокдаунов, делеции, стучать модули, мутации и т.д. на рост опухоли и выживания.
Ряд публикаций документу опухоли исследования, используя разнообразные внутричерепных методов. Ямада и др. Сделал детальное изучение инъекции красителя и от U87 клеток и обнаружили, что минимизация объема и впрыска скорость производится лучшее опухоль 2. . Брукс др нашли превосходную воспроизводимость и эффективность, используя микропроцессорным управлением инжектор, а не ручной метод для доставки вирусных векторов; их выводы относительно оптимальных параметров впрыска применимы к поставке клеток 3. Shankavaram и соавт. Показали, что глиобластомы (GBM) вводили клеточные линии ортотопически (с использованием ручной метод) в мозг обобщены профиля экспрессии генов в клinical опухоли более тесно, чем либо в пробирке или SQ ксенотрансплантатах, поддерживая использование внутричерепных моделей для доклинических исследований 4. Джаннини и др. Вводили клетки от хирургических образцов человека, который был выдержан в флангах голых мышей по серийному пассажей в мозги дополнительных мышей, и показали, что этот подход сохранился пациента гена опухоли изменения в модели 5. Подобные результаты были получены Yi соавт 6. Использование стереотаксической установки, тщательно определенный участок инъекции, и медленный и стабильный коэффициент инжекции, они получили воспроизводимые опухолей головного мозга с последовательными темпами роста и высокой (100%) скорости приживления. Справедливость этой техники, поэтому были хорошо известна; Поиск литературы показывает, что применение этого метода весьма обширны. Карти и др. Используется внутричерепные инъекции успешно доставить вирусные векторы, выражающие терапевтических генов в лобной коре transgeniС моделью болезни Альцгеймера 7. Тачи и соавт. Описали использование внутричерепных инъекций для доставки терапевтических онколитического аденовируса, в нейронной носитель на основе стволовых клеток в голых мышей, несущих уже ортотопически инъекционные GBM опухоли 8. Очевидно, внутричерепные инъекции универсальный и эффективный инструмент для доклинических исследований. Ранее публикации в журнале визуализированных экспериментов описывают фундаментальные подходы 9-11, но мы возьмем понятие внутричерепного инъекции опухоли и ортотопического моделирования на более высокий уровень точности, используя простое в мастера технологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ортотопическая мышиные модели человеческого рака мозга может стать отличным инструментом для оценки эффективности клинической терапии, но необходимо позаботиться, чтобы оптимизировать размещение клеток в ткани головного мозга. Исследования показали, что избыток объема аликвотные, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Доктор Китинг финансируется DOD грант CA100335 и Фонд Академия Святого Baldrick в.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console. | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 ul micro syringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s gauge | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% ethanol | for cleaning | ||
| Sterile di H2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull |
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
