Oprettelse Anatomisk nøjagtig og reproducerbar Intrakraniel xenotransplantater of Human hjernetumorer
Summary
Hjernen er et unikt sted med kvaliteter, der ikke er godt repræsenteret ved in vitro eller ektopiske analyser. Ortotopisk musemodeller med reproducerbare beliggenhed og vækstkarakteristika pålideligt kan oprettes med intrakranielle injektioner ved hjælp af en stereotaktisk fiksering instrument og et lavt tryk sprøjte pumpe.
Abstract
Ortotopisk tumor modeller er i øjeblikket den bedste måde at studere karakteristika en tumortype, med og uden indgriben i forbindelse med et levende dyr – især på steder med unikke fysiologiske og arkitektoniske kvaliteter, såsom hjernen In vitro og ectopiske modeller ikke kan. redegøre for funktioner såsom vaskulatur, blod-hjerne-barrieren, stofskifte, drug delivery og toksicitet, og et væld af andre relevante faktorer. Orthotopisk modeller har deres begrænsninger også, men med ordentlig teknik tumorceller af interesse kan nøjagtigt indpodet væv, der mest nøje efterligner forholdene i den menneskelige hjerne. Ved at anvende metoder, der leverer præcist afmålte mængder til præcist definerede steder på en konsekvent hastighed og tryk, musemodeller af humane hjernetumorer med forudsigelige vækstrater kan reproducerbart skabt og er egnet til pålidelig analyse af forskellige interventioner. Protokollen beskrevet her fokuserer på technical detaljer designe og forberede en intrakraniel injektion, der udfører operationen, og at sikre en vellykket og reproducerbar tumorvækst og giver udgangspunkter for en række forhold, der kan tilpasses til en række forskellige hjerne tumor-modeller.
Introduction
In vitro studier af hjernens tumorceller er uvurderlige for dissekering molekylære mekanismer, der skaber vækst, overlevelse, migration og invasion af kræftceller; dyrkede celle eksperimenter kan definere signalveje, foreslår potentielle terapeutiske mål, og karakterisere cellulære respons på lægemiddelbehandling. Men in vitro-systemer er alt for forenklet at forudsige organismal reaktion til lægemidler; de mangler de fysiologiske reaktioner, immunrespons, celle mikromiljø og samlet heterogenitet af levende dyr-systemer. Gensplejsede modeller kan være uvurderlige, når de er tilgængelige, men der findes molekylære forskelle mellem arter og murine celler ikke rekapitulere begivenheder i menneskelige processer, hvilket resulterer i betydelige uoverensstemmelser, når man sammenligner dyremodeller til kliniske observationer 1. Mus xenograftmodeller involverer subkutan (SQ) injektion af humane hjerne tumor cellelinier under huden på flanken er nemme at udføreog måle; de kan bruges til at behandle virkningerne af gen-modifikation and Drug Administration / levering, metabolisme og toksicitet. Væsentlige ulemper begrænser imidlertid anvendeligheden af SQ-modeller. Mikromiljø ikke rekapitulere det af en naturligt forekommende hjernesvulst: samspillet mellem forskellige celletyper og væv; den lokale vaskulatur, og talrige andre faktorer unikke for hjernen ikke kan gentages. For mere præcist at reproducere den unikke miljø i et naturligt forekommende hjernetumor og afprøve virkningerne af farmaceutiske indgreb bør en mus orthotopisk model anvendes. Desuden kan ortotopisk teknikker anvendes som en del af, hvor humane primære ikke-kræft celler (differentieret eller stamfader) en genetisk manipuleret tilgang er genetisk modificeret, og injiceres i den relevante stedet for en mus, med eller uden menneskelig stroma celler, hvilket resulterer i tumorigenese svarende til den, der ses hos mennesker 1.
Denne artikel beskriveren metode til præcist og reproducerbart skabe hjernesvulster hos mus. Ved hjælp af denne teknik, kan brugeren nøjagtigt indsprøjte en lille portion af suspenderede celler i en bestemt placering af frontoparietale parieto-temporale region af muse hjernebarken. Dødelighed Mouse er ekstremt lavt; i vores hænder, har ingen mus døde af kirurgiske komplikationer efter 185 procedurer. Karakteristik af den resulterende tumor kan sammenlignes med typiske humane kliniske tumorer; for eksempel: hurtige vækst, graden af nekrose, omfanget af invasion, heterogenitet celletype, tilstedeværelse af mitotiske celler, markører for proliferation og apoptose mv cellelinjer eller disaggregerede humant væv eller tumor prøver kan så blive vurderet på grundlag af deres evne at simulere faktiske kliniske præsentation. Pharmaceuticals, valgt baseret på deres præstation i cellekultur, kan afprøves i forbindelse med et velfungerende stofskifte, kredsløbssygdomme, og blod-hjerne-barrieren, som de eksisterer i et dyr belastet witha tumor, alt sammen i et relevant arkitektonisk sammenhæng. Desuden kan cellerne valgt til injektion være genetisk modificeret til at undersøge effekten af specifikke knockdowns, sletninger, knock-ins, mutationer, etc. på tumorvækst og overlevelse.
En række publikationer dokumenterer tumorer undersøgelser under anvendelse af en række intrakranielle teknikker. Yamada et al. Gjorde en detaljeret undersøgelse af injektion af farvestof og U87-celler og fandt, at minimere volumen og injektion sats produceret den bedste tumor 2. . Brooks et al fundet overlegen reproducerbarhed og effektivitet ved hjælp af en mikroprocessorstyret injektor snarere end en manuel metode til at levere virale vektorer; deres konklusioner vedrørende optimale indsprøjtning parametre gælder for celle levering 3. Shankavaram et al. Viste, glioblastoma multiforme (GBM) cellelinier injiceret orthotopisk (ved hjælp af en manuel metode) i hjernen gentaget genekspressionsprofilen af clinical tumorer tættere end enten in vitro eller SQ xenografterne støtte brugen af intrakranielle modeller for prækliniske studier 4. Giannini et al. Injicerede celler fra humane kirurgiske prøver, der var blevet opretholdt i flankerne af nøgne mus ved seriepassage i hjernen på yderligere mus, og viste, at denne fremgangsmåde konserveret patientens tumor genændringer i modellen 5. Lignende resultater blev rapporteret af Yi et al 6. Ved hjælp af en stereotaktisk opsætning, defineres omhyggeligt injektionsstedet, og en langsom og støt injektion hastighed, de har opnået reproducerbare hjernetumorer med ensartede vækstrater og høj (100%) transplantation sats. Validiteten af denne teknik er derfor blevet veletableret; en litteratursøgning tyder på, at anvendelser af denne teknik er omfattende. Carty et al. Anvendes intrakranielle injektioner med succes levere virale vektorer, der udtrykker terapeutiske gener i den frontale cortex transgenic model for Alzheimers sygdom 7. Thaci et al. Beskrevet anvendelsen af intrakranielle injektioner til at levere terapeutiske onkolytisk adenovirus i en neural stamcelle baserede luftfartsselskab i nøgne mus, der allerede bærer orthotopisk injicerede GBM tumorer 8. Det er klart, intrakranielle injektioner er en alsidig og effektivt værktøj til præklinisk forskning. Tidligere publikationer i Journal of visualiserede Eksperimenter beskriver grundlæggende tilgange 9-11, men vi tager begrebet intrakraniel tumor indsprøjtning og ortotopisk modellering til en højere grad af præcision ved hjælp af let-til-mester-teknologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ortotopisk musemodeller af human kræft i hjernen kan være et udmærket redskab til at vurdere effektiviteten af kliniske behandlinger, men pleje skal tages for at optimere placeringen af celler i hjernevæv. Undersøgelser har vist, at for store alikvote mængder, suboptimal injektionsteknik og forhastede injektionsrater kan føre til utætheder og fremkomsten af tumorceller i uønskede steder (ventrikler, rygmarv, extradural regioner, mv.) Og høj variation i tumor størrelse 2 (person…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Keating er finansieret af DOD tilskud CA100335 og er en St. Baldrick Fond Scholar.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console. | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 ul micro syringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s gauge | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% ethanol | for cleaning | ||
| Sterile di H2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull |
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
