Analyse en temps réel de profil métabolique dans<em> Ex Vivo</em> Cultures souris intestinale Crypte organoïde
Summary
Les petits organites des cryptes intestinales en culture ex vivo de fournir un système de culture de tissu qui récapitule croissance des cryptes charge sur les cellules souches et leur niche. Nous avons établi une méthode pour analyser le profil métabolique en temps réel organites de la crypte de la souris primaire. Nous avons trouvé organites maintenir les propriétés physiologiques définis par leur source.
Abstract
La muqueuse intestinale présente une architecture répétitive organisée en deux structures fondamentales: villosités, faisant saillie dans la lumière intestinale et composées d'entérocytes matures, des cellules caliciformes et des cellules entéro-endocrines; et cryptes, résidant à proximité de la sous-muqueuse et la musculeuse, l'hébergement souches adultes et des cellules progénitrices et des cellules matures de Paneth, ainsi que du stroma et les cellules immunitaires du microenvironnement de la crypte. Jusqu'à ces dernières années, des études in vitro de l'intestin grêle a été limité à des lignées cellulaires dérivées de tumeurs bénignes ou malignes, et ne pas représenter la physiologie de l'épithélium intestinale normale et l'influence du microenvironnement dans lequel ils résident. Ici, nous démontrons une méthode adaptée de Sato et al. (2009) pour la mise en culture primaire organites des cryptes intestinales de souris dérivées de souris C57BL / 6. En outre, nous présentons l'utilisation de cultures organoïdes crypte de doser le profil métabolique crypte en temps réel par mesurement de la consommation de base d'oxygène, le taux de la glycolyse, la production d'ATP et de la capacité respiratoire. Organites conservent les propriétés définies par leur source et conservent les aspects de leur adaptation métabolique réfléchie par la consommation d'oxygène et les taux d'acidification extracellulaire. Études métaboliques en temps réel dans cette crypte organoïde de système de culture sont un outil puissant pour étudier le métabolisme de l'énergie organoïde crypte, et comment elle peut être modulée par des facteurs nutritionnels et pharmacologiques.
Introduction
Le cancer colorectal (CCR) est la troisième cause de décès liés au cancer aux États-Unis. Cancer du côlon sporadique –à-dire celle qui résulte plus tard dans la vie (> 50 ans) et sans facteurs génétiques prédisposant claires – représentent environ 80% de tous les cas, avec une incidence fortement influencée par les habitudes alimentaires à long terme 1,2. Ces tumeurs présentent un changement métabolique à la dépendance de la glycolyse oxydatif, connu comme l'effet Warburg, qui peut en partie faire des concentrations plus élevées de blocs de construction cellulaires et de l'énergie disponibles (par glutaminolysis) pour permettre et peut-être d'atteindre des taux élevés de prolifération des cellules tumorales 3-5 . Études sur le cancer du côlon ainsi que d'autres cancers gastro-intestinaux, y compris les petits cancers de l'intestin fournissent des indications importantes sur la cause de la formation de tumeurs. Étudier les différences métaboliques entre les états normaux, pro-tumorigènes et tumorigènes de systèmes d'organes gastro-intestinaux peuvent aider detESILIATION de risque relatif pour le développement de la tumeur ainsi que la détection précoce des néoplasies. De plus, la compréhension de métabolisme bioénergétique impliquant la respiration mitochondriale et la glycolyse donnera un aperçu fondamental dans la façon dont la physiologie cellulaire, le vieillissement et la maladie perturbe l'homéostasie intestinale état. L'utilisation de la technologie bioénergétique de dosage pour l'analyse de flux extracellulaire peut évaluer le taux de respiration mitochondriale et de la glycolyse en même temps dans les cellules en croissance en culture en temps réel de 6,7.
Jusqu'à récemment, les études in vitro de l'intestin grêle ont été limités à des lignées cellulaires dérivées de tumeurs bénignes ou malignes 8,9 et ne représentent pas la physiologie de l'épithélium intestinale normale et l'influence du micro-environnement dans lequel elles résident. En 2009, Sato et al. 10 ex vivo introduit un système de culture à croissance tridimensionnelle (3D) de souris organites épithéliales de l'intestin, ou epithElial «mini-tripes", adapté à des recherches expérimentales, diagnostiques et thérapeutiques 10,11. En outre, cryptes isolées de souris soumis à restriction calorique maintenir leurs propriétés de croissance modifiées que organites dans ces cultures 12. Par rapport à des lignées cellulaires transformées, cultures organoïdes crypte peuvent être utilisés pour générer des données physiologiquement pertinents présentant une bien meilleure modèle pour comprendre l'état in vivo.
Nous avons adapté la technologie d'analyse bioénergétique pour doser le métabolisme énergétique des organites des cryptes intestinales. Souris organites de la crypte intestinale ont été cultivées ex vivo de développer les études sur le métabolisme de l'énergie organoïdes crypte présentés. Le taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) des organites cryptes ont été mesurées en l'absence et en présence de deux inhibiteurs différents métaboliques (oligomycine, la roténone) et un transporteur d'ions (carbonyl cyanure p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). L'orga crypteréponse métabolique solénoïde à ces composés chimiques ont été traduit avec succès en changeant ECAR et valeurs OCR.
Études bioénergétiques cellulaires permettent d'élucider les interactions réciproques entre l'état métabolique et le risque de maladie et le phénotype dans le cancer, l'obésité, le diabète, les maladies métaboliques et les maladies mitochondriales et aider méthodes de dépistage à l'avance avec des implications directes pour la médecine translationnelle. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler petites cryptes intestinales et à la culture organites de la crypte. En outre, nous introduisons une nouvelle méthode pour utiliser des cultures organoïdes crypte pour les essais métaboliques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons testé le taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) de cryptes isolées à partir de souris âgées de 8 mois et cultivées en organites ex vivo. Après la mesure du taux de base, le métabolisme crypte a été évaluée en ajoutant oligomycine, cyanure de carbonyle -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) et la roténone, séquentiellement.
Basal OCR et ECAR base ont été enregistrées 0-29 min (figure 2A</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions SR1 CA 135561, R01 CA151494, CA174432 et R01 P3013330 des Instituts nationaux de la santé.
Nous tenons à remercier Michele Houston, Elena Dhima et le Dr Anna Velcich pour leurs précieux commentaires dans l'élaboration du protocole d'isolement de la crypte.
Nous remercions également la formation sur le diabète et le Centre de recherche de l'Albert Einstein College of Medicine soutenu par le NIH P60DK20541, et le Dr Michael Brownlee et le Dr Xue Liang-Du, qui dirigent et exploiter les installations Seahorse, respectivement.
Materials
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1X) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) – step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml | Life Technologies | 15240-062 | Final Concentration 1 X or 2 X |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final Concentration 10 mM |
| N-Acetyl-L-Cysteine, 25g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final Concentration 1 mM |
| 100X N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final Concentration 1 X |
| 50X B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final Concentration 1 X |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final Concentration 500 ng / mL |
| Recombinant Murine EGF, 100ug | Peprotech | 315-09 | Final Concentration 50 ng / mL |
| Recombinant Murine Noggin, 20ug | Peprotech | 250-38 | Final Concentration 100 ng / mL |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final Concentration 2 mM |
| Gibco® Glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final Concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| DTT (Dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final Concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1 % in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1 % in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final Concentration 10 µM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final Concentration 1 µM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final Concentration 1 µM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final Concentration 1 µM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final Concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
References
- Jemal, A., et al. . CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
