Real Time Analys av Metabolic profil i<em> Ex vivo</em> Mouse Intestinal Crypt organoid kulturer
Summary
Små intestinala crypt organoids odlade ex vivo tillhandahålla ett vävnadskultursystem som rekapitulerar tillväxten av kryptor beroende av stamceller och deras nisch. Vi etablerade en metod för att analysera den metaboliska profilen i realtid i primär mus crypt organoids. Vi hittade organoids upprätthålla fysiologiska egenskaper som definieras av deras källa.
Abstract
Tunntarmens slemhinna uppvisar en repetitiv arkitektur organiserad i två grundstrukturer: villi, som skjuter in i tarmlumen och består av mogna enterocyter, bägarceller och enteroendocrine celler; och kryptor, bor proximalt till submukosa och muscularis, hysande adulta stamceller och stamfaderceller och mogna Paneth-celler, liksom stromala och immunceller i kryptan mikromiljö. Tills de senaste åren, in vitro-studier av tunntarmen var begränsad till cellinjer härledda från antingen godartade eller elakartade tumörer, och inte representerar fysiologi normala tarm epitel och påverkan av mikromiljön där de är bosatta. Här visar vi en metod anpassad från Sato et al. (2009) för odling av primära mus intestinal crypt organoids härrörande från C57BL / 6-möss. Dessutom presenterar vi användning av crypt organoid kulturer för att analysera kryptan metaboliska profil i realtid per åtgärdlingen av basal syreförbrukning, glykolytiska takt, ATP-produktion och kapacitet i luftvägarna. Organoids bibehålla egenskaper som definieras genom sin källa och behålla delar av sin metaboliska anpassning reflekteras av syreförbrukning och extracellulära försurningspriser. Realtid metaboliska studier i denna krypta organoid odlingssystem är ett kraftfullt verktyg för att studera crypt organoid energimetabolism, och hur den kan moduleras av närings- och farmakologiska faktorer.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i USA. Sporadisk koloncancer – dvs den som uppkommer senare i livet (> 50 år) och med några tydliga predisponerar genetiska faktorer – står för ~ 80% av alla fall, med förekomst starkt influerad av långsiktiga kostvanor 1,2. Dessa tumörer uppvisar en metabolisk övergång till beroende av oxidativ glykolys, känd som Warburg effekt, vilket delvis kan göra högre koncentrationer av cellulära byggstenar och energi som finns (genom glutaminolysis) för att tillåta och kanske köra höga tumörcelltillväxt 3-5 . Studier av tjocktarmscancer och andra gastrointestinala cancerformer inklusive tunntarmscancer ger viktiga insikter om orsaken till tumörbildning. Undersöka de metaboliska skillnader mellan normala, pro-tumorigena och tumörframkallande tillstånd av gastrointestinala organsystem kan hjälpa DETermination av relativ risk för tumörutveckling samt tidig upptäckt av neoplasi. Dessutom kommer förstå bioenergetiska metabolism involverar mitokondrie andning och glykolys ge grundläggande insikt i hur cellfysiologi, åldrande och sjukdomstillstånd stör tarm homeostas. Utnyttjande av bioenergetik analysteknik för extracellulärt flödesanalys kan bedöma andelen mitokondrie andning och glykolys samtidigt i celler som växer i kultur i realtid 6,7.
Fram till nyligen var in vitro-studier av tunntarmen begränsad till cellinjer härledda från antingen godartade eller elakartade tumörer 8,9 och inte representerar fysiologi normala tarm epitel och påverkan av mikromiljön där de är bosatta. Under 2009 al. Sato et 10 införde en ex vivo kultur system att växa tredimensionella (3D) mus intestinala epitelceller organoids eller epithelial "mini-guts", lämplig för försök, diagnostiska och terapeutiska undersökningar 10,11. Dessutom kryptor som isolerats från calorically restriktions möss bibehålla sina förändrade tillväxtegenskaper som organoids i sådana kulturer 12. Jämfört med transformerade cellinjer kan crypt organoid kulturer användas för att alstra fysiologiskt relevanta data som utgör en mycket bättre modell för att förstå den in vivo-tillståndet.
Vi anpassade bioenergetik analysteknik för att analysera energiomsättningen av intestinala crypt organoids. Mus intestinal crypt organoids odlades ex vivo för att utveckla kryptan organoid energimetabolismstudier som presenteras. Syreförbrukningshastigheten (OCR) och den extracellulära försurning hastigheten (ECAR) av crypt organoids mättes i frånvaro och närvaro av två olika metaboliska hämmare (oligomycin, rotenon) och en jon bärare (karbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Kryptan organoid metaboliska svar på dessa kemiska föreningar framgångsrikt reflekteras genom att ändra ECAR och OCR-värden.
Cellular bioenergetiska studier kommer belysa de ömsesidiga samspelet mellan metaboliskt tillstånd och sjukdomsrisk och fenotyp i cancer, fetma, diabetes, ämnesomsättningsstörningar och mitokondriella sjukdomar och hjälpa förväg screeningmetoder med direkta konsekvenser för translationell medicin. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera små tarm kryptor och kultur crypt organoids. Dessutom introducerar vi en ny metod för att använda crypt organoid kulturer för metabola analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi testade syreförbrukningshastigheten (OCR) och den extracellulära försurning hastigheten (ECAR) av kryptor isolerade från 8 månader gamla möss och vuxit till organoids ex vivo. Efter mätning av basaldosen, var crypt ämnesomsättning utvärderades genom att lägga oligomycin, karbonyl cyanid -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) och rotenon, sekventiellt.
Basal OCR och basal ECAR registrerades 0-29 min (Figur 2A och 2B). Vid den 29…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien har finansierats med bidrag RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 och P3013330 från National Institutes of Health.
Vi vill tacka Michele Houston, Elena Dhima och Dr Anna Velcich för värdefulla synpunkter på utvecklingen kryptan isoleringsprotokoll.
Vi tackar också Diabetes Training and Research Center i Albert Einstein College of Medicine stöd av NIH P60DK20541, och Dr. Michael Brownlee och Dr. Xue Liang Du, som styr och driva Sjöhäst anläggningen, respektive.
Materials
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1X) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) – step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml | Life Technologies | 15240-062 | Final Concentration 1 X or 2 X |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final Concentration 10 mM |
| N-Acetyl-L-Cysteine, 25g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final Concentration 1 mM |
| 100X N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final Concentration 1 X |
| 50X B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final Concentration 1 X |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final Concentration 500 ng / mL |
| Recombinant Murine EGF, 100ug | Peprotech | 315-09 | Final Concentration 50 ng / mL |
| Recombinant Murine Noggin, 20ug | Peprotech | 250-38 | Final Concentration 100 ng / mL |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final Concentration 2 mM |
| Gibco® Glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final Concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| DTT (Dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final Concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1 % in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1 % in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final Concentration 10 µM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final Concentration 1 µM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final Concentration 1 µM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final Concentration 1 µM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final Concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
References
- Jemal, A., et al. . CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
