Tempo real Análise do Perfil metabólico em<em> Ex Vivo</em> Culturas mouse Intestinal Crypt organóide

Summary

Pequenas Organóides cripta intestinal cultivadas ex vivo, proporcionam um sistema de cultura de tecidos que recapitula o crescimento das criptas dependentes de células-tronco e seu nicho. Foi estabelecido um método para ensaiar o perfil metabólico em tempo real em Organóides das criptas do rato primária. Encontramos Organóides manter as propriedades fisiológicas definidas por sua origem.

Abstract

A mucosa do intestino delgado apresenta uma arquitetura repetitivo organizado em duas estruturas fundamentais: vilosidades, projetando para o lúmen intestinal e composto por enterócitos maduros, células caliciformes e células enteroendócrinas; e criptas, residentes proximal para a submucosa e muscularis, abrigando estaminais adultas e nas células progenitoras e células de Paneth madura, bem como do estroma e as células imunes do microambiente cripta. Até aos últimos anos, estudos in vitro do intestino delgado foi limitado a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos, e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Aqui, demonstramos um método adaptado de Sato et al. (2009) para a cultura de Organóides das criptas intestinais do rato primárias derivadas de ratinhos C57BL / 6. Além disso, apresentamos a utilização de culturas organóide cripta para analisar o perfil metabólico cripta em tempo real por medidamento do consumo basal de oxigênio, a taxa glicolítica, a produção de ATP e da capacidade respiratória. Organóides manter as propriedades definidas por sua origem e reter os aspectos de sua adaptação metabólica refletido pelo consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular. Estudos metabólicos em tempo real no presente cripta organ�de sistema de cultura são uma ferramenta poderosa para estudar o metabolismo da energia organ�de cripta, e como ela pode ser modulado por factores nutricionais e farmacológicas.

Introduction

O câncer colorretal (CCR) é a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Câncer de cólon esporádico – ou seja, que resulta mais tarde na vida (> 50 anos de idade) e sem fatores predisponentes genéticos claras – contas para ~ 80% de todos os casos, com incidência fortemente influenciada por padrões alimentares a longo prazo ^1,2. Estes tumores exibem um desvio metabólico no sentido para a glicólise oxidativo, conhecido como o efeito de Warburg, que pode, em parte, tornar as concentrações mais elevadas de blocos de construção celulares e energia disponíveis (através glutaminolysis) para permitir a conduzir e, talvez, as altas taxas de proliferação de células tumorais ^3-5 . Estudos de câncer de cólon, bem como outros cânceres gastrointestinais, incluindo cânceres do intestino delgado fornecer informação importante sobre a causa da formação de tumores. Investigando as diferenças metabólicas entre os estados normais, pró-tumorigênicos e tumorigênicos de sistemas de órgãos gastrointestinais podem ajudar determination de risco relativo para o desenvolvimento do tumor, bem como a detecção precoce de neoplasia. Além disso, a compreensão do metabolismo bioenergético envolvendo respiração mitocondrial e da glicólise irá fornecer informações fundamentais sobre a forma como a fisiologia celular, o envelhecimento e as doenças estado perturba a homeostase intestinal. A utilização da tecnologia de ensaio para análise bioenergética fluxo extracelular pode avaliar as taxas de respiração mitocondrial e, simultaneamente, a glicólise em células que crescem em cultura em tempo real, ^6,7.

Até recentemente, os estudos in vitro de intestino delgado foram limitadas a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos ou ^8,9 e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Em 2009, Sato et al. ¹⁰ introduziu um sistema de cultura ex vivo para crescer tridimensional do mouse (3D) Organóides intestinais epiteliais, ou epithElial "mini-coragem", adequado para investigações experimentais, diagnósticos e terapêuticos ^10,11. Além disso, criptas isolados de ratos sob restrição calórica manter suas propriedades de crescimento alterados como Organóides em tais culturas ^12. Em comparação com linhas celulares transformadas, culturas organ�de criptas pode ser usado para gerar os dados fisiologicamente relevantes que apresentem um modelo muito melhor para compreender o estado in vivo.

Nós adaptamos a tecnologia de análise bioenergética para ensaio de metabolismo energético de Organóides cripta intestinal. Rato cripta intestinal Organóides foram cultivadas ex vivo para desenvolver os estudos do metabolismo energético organóide cripta apresentados. A taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de Organóides criptas foram medidos na ausência e na presença de dois diferentes inibidores metabólicos (oligomicina, rotenona) e um transportador de iões (carbonil-cianeto de p-Trifluormetoxifenilidrazona). A cripta orgaresposta metabólica noid a estes compostos químicos foram refletidos com sucesso através da mudança ECAR e valores de OCR.

Estudos bioenergéticos celulares irá elucidar as interações recíprocas entre o estado metabólico e risco de doença e fenótipo em câncer, obesidade, diabetes, distúrbios metabólicos e doenças mitocondriais e ajudar métodos de rastreio antecipadamente com implicações diretas para a medicina translacional. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para isolar pequenas criptas intestinais e Organóides cripta cultura. Além disso, introduzimos um novo método de usar culturas organóide cripta para ensaios metabólicos.

Protocol

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal do Albert Einstein College of Medicine. 1. Crypt Isolamento e Cultura O isolamento das criptas do intestino delgado: Isolar criptas intestinais de qualquer modelo de ratos de interesse. Euthanize os ratos com CO 2, seguida por deslocação c…

Representative Results

Organóides da cripta foram estabelecidos a partir de oito meses de idade camundongos C57BL / 6 alimentados com dieta purificada roedor Instituto Americano de Nutrição 76A (AIN76A). Organóides criptas intestinais podem ser cultivadas em cultura durante longos períodos de tempo a partir de um único cripta (Figura 1A, única seta vermelha). Organóides crescer para fora da cripta estruturas semelhantes em 18-20 dias em cultura (Figura 1B, setas vermelhas). Criptas foram passadas a ca…

Discussion

Testamos a taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de criptas isolados a partir de 8 meses de idade e ratinhos cultivadas em Organóides ex vivo. Após a medição da taxa basal, metabolismo cripta foi avaliada adicionando oligomicina, cianeto de carbonilo -p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) e rotenona, sequencialmente.

Basal OCR e ECAR basal foram gravadas 0-29 min (Figura 2A e 2B). No dia ²⁹ m…

Materials

BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1X)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol Red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) – step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml	Life Technologies	15240-062	Final Concentration 1 X or 2 X
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final Concentration 1 X
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final Concentration 1 X
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final Concentration 10 mM
N-Acetyl-L-Cysteine, 25g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final Concentration 1 mM
100X N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final Concentration 1 X
50X B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final Concentration 1 X
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug	R&D Systems	3474-RS-050	Final Concentration 500 ng / mL
Recombinant Murine EGF, 100ug	Peprotech	315-09	Final Concentration 50 ng / mL
Recombinant Murine Noggin, 20ug	Peprotech	250-38	Final Concentration 100 ng / mL
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final Concentration 2 mM
Gibco® Glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final Concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
DTT (Dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final Concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1 % in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1 % in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final Concentration 10 µM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final Concentration 1 µM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final Concentration 1 µM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final Concentration 1 µM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final Concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience