Brain myeloide celler karakterisering efter slagtilfælde kan udføres ved stereologi anvendelse af optisk fraktioneringskolonne metode eller ved en flowcytometrisk analyse af hjernen leukocytter suspensioner. Begge er nyttige teknikker til at udføre en nøjagtig fænotypisk forskel på de vigtigste myeloide celledelmængder fundet i iskæmisk hjernen.
Mikroglia aktivering samt ekstravasation af hæmatogen makrofager og neutrofiler, menes at spille en central rolle i hjerneskade efter slagtilfælde. Disse myeloide cellesubpopulationer kan vise forskellige fænotyper og funktioner og skal være fremtrædende og karakteriseret for at studere deres regulering og bidrag til vævsskade. Denne protokol giver to forskellige metoder til hjerne immun celle karakterisering: en præcis Stereologisk tilgang og en flowcytometrisk analyse. Den Stereologisk tilgang er baseret på den optiske fraktionator metode, der beregner det samlede antal celler i et område af interesse (infarkt hjernen) estimeres ved en systematisk stikprøver. Den anden karakterisering fremgangsmåde giver en enkel måde at isolere hjernens leukocyt suspensioner og karakterisere ved flowcytometri, giver mulighed for karakterisering af mikroglia, infiltreret monocytter og neutrofiler i det iskæmiske væv. Derudover er det også Letails en cerebral iskæmi model i mus, der udelukkende påvirker hjernens cortex, genererer meget reproducerbare infarkter med en lav dødelighed, og proceduren for histologiske hjerne behandling for at karakterisere infarktvolumen ved Cavalieri metoden.
Morfologiske, fænotypiske og genekspression ændringer i mikroglia samt ekstravasation og aktivering af hæmatogen makrofager og neutrofiler menes at spille en afgørende rolle i den patofysiologiske kaskade efter hjerneskade 1-4. Denne protokol giver to fremgangsmåder til at estimere antallet af forskellige myeloid celle delgrupper i den iskæmiske hjerne og til at udføre deres fænotypisk karakterisering. Derudover giver det også en beskrivelse af en eksperimentel model for cerebral iskæmi i mus, som består af forbigående eller permanent ligering af både distale arteria cerebri (MCA) og den fælles carotidarterie (CCA), herunder hvordan at evaluere infarkt ved nøjagtig Cavalieri metoden i en Stereologisk software.
Den første metode til at karakterisere myeloide celledelmængder af den iskæmiske hjerne er en Stereologisk metode baseret på den optiske fraktionator tilgang 5. Dette er den mestalmindeligt anvendt Stereologisk sonde i biovidenskab og giver en høj grad af præcision med lave koefficienter af fejl 5-7. Dette er det bedste valg for celle kvantificering når vævet skæres i sektioner, da man derved undgår bias på celle estimering grund af opsplitningen af vævet i sektioner. Denne metode er en meget effektiv måde at karakterisere numre, dynamik og fænotypiske ændringer af infiltreret neutrofile subpopulationer af det iskæmiske væv 8.
Den anden karakterisering tilgang er baseret på en modificeret protokol fra Campanella og samarbejdspartnere 9, der giver en enkel måde at isolere hjernen leukocyt suspensioner og at beskrive dem ved flowcytometri. I modsætning til konventionelle immunhistokemiske teknikker, flowcytometri karakterisering tillader at skelne mellem mikroglia (CD45 lo CD11b +) og infiltreret myeloide celler (CD45 hi CD11b +) baseret på deres different ekspressionsniveauer af CD45 9-13. Desuden proinflammatoriske monocytter (CD45 hi CD11b + Ly-6G – Ly-6C hi), neutrofiler (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) og andre leukocytter delmængder af den iskæmiske væv kan skelnes. Denne fremgangsmåde giver en pålidelig og hurtig assay til at vurdere neuroinflammation i eksperimentelle modeller af hjerneiskæmi. Imidlertid kan vævsbehandling påvirke aktivering tilstand og antallet af de forskellige cellepopulationer fundet i iskæmisk væv give en semi-kvantitativ karakterisering.
Den cerebral iskæmi model introduceret her giver meget reproducerbare infarktvolumener bestemt 24-48 timer og 7 dage efter MCA ligering af forskellige tilgange 8,15,17. Denne MCAO model har en lav dødelighed (mindre end 1%) i forhold til andre, minimere antallet af dyr, der anvendes i undersøgelser. Et afgørende skridt for at opnå denne lave dødelighed er at opretholde ordentlig aseptiske forhold for at undgå infektioner, som kan påvirke overlevelse efter slagtilfælde induktion. Denne MCAO model kan ikke kun bruges som en permanent MCAO model, der betragtes som en klinisk relevant model for translationel forskning 18, men også som en midlertidig model ved forbigående ligering af CCA og MCA med en slipknot og bageste reperfusion på det ønskede tidspunkt 19. Denne metode er blevet anvendt med succes i mus og rotter 17,20. Alt dette beviser indikerer, at MCAO ved ligering er en høj alsidig model af cerebral iskæmi med flere programmer. En critical trin af denne teknik er, at det kræver invasiv kirurgi under et stereomikroskop; kraniotomi skal udføres meget omhyggeligt for ikke at beskadige kindbenet samt MCA. Dog (ikke udføres, der udsættes for den kirurgiske procedure, men CCA og MCA ligering), anvendelse af skin dyr giver et nyttigt værktøj til at skelne kirurgisk procedure-afhængige virkninger. Omfanget af hjerneskade efter denne teknik kan kvantificeres ved flere metoder. Vores protokol hjerne skæring Nissl farvning og efterfølgende vurdering af omfanget af Cavalieri giver mulighed for en nøjagtig kvantificering af den beskadigede region og minimerer antallet af mus, der anvendes i denne type undersøgelser, eftersom serielle hjerne sektioner kan også anvendes til forskellige immunhistokemisk analyse. For en bedre ydeevne af denne metode, er det afgørende at vælge de relevante parametre, der anvendes i stereologi software (tabel 1), som vil være nødvendige for at estimere the mængden af de forskellige regioner ved formlen: V = 1 / SSF * en f * t * ΣP I (SSF er fraktionen skive prøveudtagning, T er den gennemsnitlige tykkelse af sektionerne, en f er det område af gitterafstand og ΣP antallet af point rammer struktur).
Den distale MCAO ved ligering kan være nyttigt at karakterisere infiltreret leukocyt- og immune cellesubpopulationer 8,13 der deltager i den inflammatoriske proces efter hjerneskade 1-4. Her foreslår vi to forskellige metoder til hjernen immuncelle karakterisering, en præcis Stereologisk tilgang og en flowcytometrisk analyse muligt at indkredse flere leukocytter subpopulationer.
Udnyttelse af seriel hjerne sektionering, kan kvantificering af det totale antal neutrofiler opnås ved den optiske fraktioneringskolonne metode 16, der anslår det samlede antal af celler fra antallet af celler udtages Witha Systematic stikprøver (SRS) sæt uvildige virtuelle optælling områder, der dækker hele regionen af interesse, i vores tilfælde infarkt regionen, med ensartet afstand mellem uvildige virtuelle optælling rum i retninger X, Y og Z. Denne metode giver en nøjagtig redskab til anslå samlede neutrofile numre i den iskæmiske hjerne på forskellige tidspunkter efter ligering. Selv om det ikke er påvist i denne undersøgelse, kan denne protokol også anvendes til estimering af de forskellige neutrofile subpopulationer efter iskæmi 21 og for en nøjagtig kvantificering af enhver anden celle population findes i den iskæmiske hjerne ligesom andre infiltreret leukocytter (monocytter / makrofager) og også til at estimere overlevende neuroner eller endda for neurogenese kvantificering efter slagtilfælde. Det vigtigste skridt for en nøjagtig vurdering i det ønskede område er udvælgelsen af de relevante parametre, som dem vist i tabel 3 for neutrofil kvantificering i det iskæmiske område.Disse parametre vil blive anvendt til stereologi software til at beregne den samlede positive celleantal (N) ved brug af ligningen N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / ASF x 1 / TSF (ΣQ- er det samlede antal talte celler med fraktionatoren, SSF er fraktionen afsnittet prøvetagning, asf er prøvetagning fraktion området, og TSF er fraktionen prøvetagning tykkelse) 5. Selv om denne metode er langsommere end andre kvantificering teknikker (for eksempel analyse af neutrofile markører af mg væv, densitometri af repræsentative billeder eller antal af neutrofiler pr område), har den fordel at være en objektiv og en solid teknik, som giver en præcis kvantificering af celleantal.
Hjernen leukocyt isolation fremgangsmåde giver mulighed for en samtidig identifikation og kvantificering af adskillige immune celle undertyper uden behov for at forspænde systemet ved in vivo-farvning eller genetiske manipulationer. Efterfølgende cellesortering fra kendetegnet myeloid populations eller deres immunomagnetisk adskillelse kan bruges til flere downstream applikationer, såsom yderligere undersøgelser af gen eller protein-ekspression. Den nøjagtige karakterisering af neutrofiler, monocytter og mikroglia opnået med denne fremgangsmåde tilvejebringer høj specificitet med hensyn til eksisterende metoder såsom immunhistokemiske undersøgelser, en fordel, som gør det muligt at tildele bestemte funktioner til forskellige myeloide celler, som medierer respons hjerne medfødte immunreaktion. Desuden kan det blive yderligere udvidet til at karakterisere andre hjerne befolkninger med passende etiket, ligesom blod født makrofager (CD11 + CD45 hi CD68 +), og den kan anvendes til undersøgelse af andre CNS sygdomme eller skader. Derfor er denne teknik giver et vigtigt redskab til at udforske heterogenitet af den inflammatoriske reaktion i hjernen. En største begrænsning ved denne teknik er bosat på udarbejdelsen af leukocyt suspensioner fra frisk hjernevæv, som kan ændreaktivering tilstand af cellerne eller deres antigen ændring. Selvom denne teknik giver mulighed for en mere detaljeret kvalitativ karakterisering forhold til immunohistokemiske undersøgelser, det giver en mindre nøjagtig kvantificering baseret på celle isolation. På trods af dette, effektiviteten af vores celle isolation protokol svarer til andre offentliggjorte metoder 9 og det effektivt kan anvendes til at detektere forskelle i antallet af hjernens immunceller mellem kontrol og MCAO grupper eller endda mellem MCAO grupper udsat for forskellige behandlinger 8.
Kritiske trin i denne protokol er vævet dissektion, vævet forstyrrelser procedure, og myelin fjernelse. Med hensyn til vævet indsamling, kan en normalisering trin inkluderes (ved at veje vævet indsamlet) for at undgå variation på grund af forskellige dissektion forestillinger. Desuden kan normalisering mellem forskellige MCAO grupper også forekomme gennem infarktvolumen (tidligere bestemt af Magnetic Resonance). En anden måde at løse dette problem er at anvende hele ipsilaterale hemisfære af både iskæmiske og kontrolgrupper eller endda bruge den kontralaterale hemisfære af den iskæmiske mus som en kontrol for at minimere antallet af anvendte dyr. Selv om denne fremgangsmåde undgår forskellene mellem hvert dissektion, det har en største ulempe; en fortyndingsfaktor tilsættes ved at øge det samlede antal celler, men ikke antallet af myeloide celler, som udelukkende er placeret i kernen og peri-infarkt områder af den ipsilaterale cortex. Med hensyn vævssprængning, denne protokol viser trin for den mekaniske afbrydelse af hjerneceller, undgå enzymatiske behandlinger og forebyggelse overfladeantigen ændring 9,22, et væsentligt problem for yderligere kvalitativ og kvantitativ analyse af de inflammatoriske cellesubpopulationer. Ud over udarbejdelsen af cellen suspension af interesse, myelin fjernelse fra hjernen prøver er et stærkt anbefalet skridt for at undgå interferens med downstReam applikationer, såsom immunomagnetisk celle separation eller flowcytometri 23,24. Dette kan opnås ved hjælp af forskellige metoder, såsom saccharose eller Percoll gradienter, eller anti-myelin perler. Her og baseret på tidligere studier, der sammenligner forskellige metoder til hjernen cellesuspension isolation, mekanisk afbrydelse i kombination med Percoll brug for at fjerne myelin bruges til at forbedre celleudbytter og levedygtighed 25.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |