このプロトコルは、筋ジストロフィー患者からの尿由来細胞の分離のための詳細な手順を伴います。それらは、センダイウイルスの形質導入を通じて効率的かつ迅速に再プログラミングされます。
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この記事について
サマリー
要約
異栄養性心筋症は、筋ジストロフィーのあまり理解結果である。筋ジストロフィーの患者から誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）を生成するインビトロ疾患モデル系のための貴重な細胞源であり、薬剤スクリーニング研究のために使用することができる。患者由来の尿細胞はジストロフィー性心筋1をモデル化するために、誘導多能性幹細胞への成功した再プログラミングに使用されてきた。ベクター系を統合する安全性の問題に対処する、我々は、筋ジストロフィーの患者から採取した尿細胞に山中因子の形質導入のための非組み込み型センダイウイルスベクターを使用してプロトコルを提示する。このプロトコルは、2〜3週間以内に完全に再プログラムされたクローンを生成します。多能性細胞は、流路13によりベクターフリーです。これらの異栄養性IPSCは、心筋細胞に分化し、病気のメカニズムを研究または薬物スクリーニングするために使用することができる。
概要
心筋症は、デュシェンヌ型とベッカー型筋ジストロフィー（MD）患者の死亡原因の第2位である。 X連鎖ジストロフィン遺伝子の変異が1で発生するものの：3500男性の出生、非常に少ない、プログレッシブ心筋の損傷につながる分子や細胞のイベントについて知られている。筋ジストロフィー患者由来のヒト誘導多能性幹細胞は、基礎疾患の機構を研究するために、薬剤は、1,2のスクリーニングに使用するための新規なツールとして浮上している。
皮膚生検または血液サンプルの予想不快感は、研究参加の同意を与えるために若い患者及び/またはその保護者を説得することができる。尿サンプルは、再プログラミング方法に修正可能である体細胞の非侵襲的な供給源である。我々は最近、筋ジストロフィー患者から採取した尿細胞は培養することができることを示しかつ効率的に山中因子とレトロウイルス形質導入を用いて、iPS細胞（に再プログラムしているあるOct3 / 4、Sox2の、Klf4及びc-Myc; OSKM）1。レトロウイルス遺伝子送達の欠点は、宿主染色体への初期化遺伝子のランダムな統合です。この制限を克服するために、我々は、尿細胞再プログラミングのための非組み込み型センダイウイルスを使用している。
このプロトコルは、さらなる研究のための心筋細胞または他の細胞型に分化させることができる筋ジストロフィー患者から単離された尿細胞のセンダイ....
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プロトコル
注：患者、および/またはその保護者は、研究を承認した治験審査委員会に参加するためにインフォームドコンセントを与える必要があります。
1.バッファとメディアの準備
- 洗浄緩衝液：リン酸緩衝食塩水（PBS）の99 mlの100×ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を1ml（100 U / mlペニシリン+ストレプトマイシン100μg/ mlの）を追加し、洗浄緩衝液100mlを調製する。
- 尿中前駆細胞（UPC）ミディアム：ケラチノサイト無血清（KSF）ミディアム+前駆細胞培地を等量混ぜ、UPC媒体を作製した。
- KSF中：上皮成長因子の5 ng / mlの（EGF）、ウシ下垂体抽出物の50 ng / mlの（BPE）、コレラ毒素の30 ng / mlの、およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液（100 Uを追加し、ケラチノサイト培地を調製するために/ mlペニシリン、500ミリリットルKSF培地に100μg/ mlのストレプトマイシン）。
- 前駆細胞培地：10％FBSでハム-F12培地とサプリメントの四分の一を含むDMEMの4分の3の追加、0.4 / mlのヒドロコルチゾン、0.1nMのコレラ毒素、5 / mlのインスリン、1.8×10 -4 Mのアデニン/ mlのトランスフェリン、2をx 10 -9 Mのトリヨードサイロニン、10ng / mlのEGF、およびペニシリン/....
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結果
（それぞれ97.37パーセント、97.09パーセント、および97.3％; 図1Aおよび図1B）は、ヒト尿から単離されたほとんどの前駆細胞は、CD44、CD73、およびCD146などの尿路上皮前駆細胞および周皮細胞のマーカーに対して陽性である。これらの細胞は、α平滑筋アクチン、およびビメンチン（ 図1B）のような他の間葉系マーカーを発現した。サイトケラチン-7（CK-7）、ウロプラキン（UP）-Ia＆-IIIa、尿路上皮細胞系列のマーカー（ 図1C）の弱い発現が存在するようにRT-PCR分析は、培養物中の細胞の混合集団の証拠を与える。
再プログラミングステップは、図2Aに概略的に要約されている。代表的な画像は、プロトコル（ 図2B）を通じて異なる時点の間、細胞の形態を示す。尿細胞は、再プログラミング中に石畳のパターン（4日目）に細長い、II型細胞（0日目）から変換する。 BY 12.......
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ディスカッション
性IPSCを使用して、心血管疾患のモデリングは、遺伝的寄与4-6を理解するための一般的なアプローチになってきている。患者から細胞サンプルを取得するいくつかの予期せぬ困難、特に幼い子供たちは、そのような尿収集などの非侵襲的アプローチのオプションを提供することによって回避することができる。この若い患者集団では、再プログラミングのための十分な尿細胞を得るのに十分な尿量を収集することはしばしば困難である。前採尿に流体30分を飲むように若い患者をコーチングすることは尿細胞単離の成功を向上させます。しかし、繰り返し尿コレクションがこの集団に必要な場合があります。我々は、合わせて、筋ジストロフィーを有する患者からのUCの単離および培養を最適化するために、2つの異なるプロトコル3,7を適応している。
誘導多能性幹細胞は、筋ジストロフィーpatienから皮膚線維芽細胞または尿細胞のいずれかから生成されているTS 1,2。しかし、両方の再プログラミングプロトコルは体細胞に再プログラミング因子を導入するレンチウイルスに依存した。導入遺伝子.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
>jove_content<このプロトコルの開発は、助成金番号8UL1TR000055を通じて、Advancing a Healthier WisconsinおよびNational Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Healthによって支援されました。その内容は著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。....
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 4オンス蓋付き標本カップ | STL尿サンプル収集用 | 医療用供給 | M9AMSAS340 |
| 15 ml BD-ファルコンチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 352097 | |
| 50 ml BD-ファルコンチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 352098 | |
| 丸型ガラスカバースリップ | フィッシャーサイエンティフィック | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS 仙台リプログラミングキット | ライフテクノロジー | ズ A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | ライフテクノロジー | ズ 10010-023 | |
| 溶連菌ペン w/o グルタミン | Life Technologies | 15140-122 | 37°で暖かい;使用前のCウォーターバス |
| RPMIミディアム1640 | ライフテクノロジー | ズ11875-0933333333377 | °Cで暖かい;使用前のCウォーターバス |
| B-27サプリメントw /インスリン(50x) | ライフテクノロジー | ズ17504-0443333 | で暖かい;Cウォーターバス使用前の |
| B-27サプリメントw / oインスリン(50x) | Life Technologies | 0050129SA37 | °Cで暖かい;使用前のCウォーターバス |
| DMEM / F12(1:1) | Life Technologies | 11330-032 | 37°Cで暖かい;使用前のCウォーターバス |
| Versene、1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | 37°で暖かい。使用前のCウォーターバス |
| bFGF(10µg) | Life Technologies | 13256-029 | 37°Cで暖かい。使用前のCウォーターバス |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | 37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前の |
| 回復細胞培養凍結中 | 期生命技術 | 12648-010 | |
| ケラチノサイト-SFM(1x)、リキッド | ライフ技術 | 17005-042333 | で暖かい。使用前のCウォーターバス |
| DMEM、高グルコース、Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | 37°Cで暖かい; |
| ハムのF-12栄養ミックス | Life Technologies | 11765-054 | 37°Cで暖かい;EGF |
| 組換えヒトタンパク質、液体形態 | 生命技術 | PHG0311L | 37°Cで暖かい前にCウォーターバス。Cウォーターバス使用前 |
| インスリン、ヒト組換え体、亜鉛ソルン | ライフテクノロジー | ズ12585-014 | 37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス |
| TeSR-E8 | 細胞技術 | 5940 | 37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス |
| ROCK阻害剤(Y-27632) | Selleck | S1049 | 37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス |
| マトリゲル | BDバイオサイエンス | 354277 | hESC認定マトリックス、LVED |
| フリーRNeasyミニキット | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA 合成キット | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS 認定 | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °使用前のCウォーターバス |
| アデニンバイオ試薬 | シグマアルドリッチ | A2786-5G | 37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前の |
| コレラ毒素ビブリオコレラ | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | 37°C;使用前のCウォーターバス |
| ヒドロコルチゾン | シグマアルドリッチ | H0888-1G37 | °Cで暖かい;Cウォーターバス使用前の |
| Sigma Aldrich | T0665-50MG | からのホロトランスフェリン | 37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前 |
| 3,3',5-Triiodo-L-チロニンナトリウム塩 | Sigma Aldrich | T6397-100MG | 37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前 |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous 封入剤 | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% パラホルムアルデヒド | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| strong>Mouse anti CD44 - 標識 FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| マウス抗CD146 - PEで標識 | BD Biosciences | 561013 | |
| マウス抗CD73 - PEで標識 | BD Biosciences | 561014 | |
| マウス抗アルファ - 平滑筋アクチン | Sigma Aldrich | A2547 | |
| マウス抗ビメンチン | Abcam | ab8978-100 | |
| マウス抗 - TRA-1-81 | ライフテクノロジー | ズ411100 | |
| ウサギ反10月3/4 | サンタクルーズ | バイオテクノロジーSC-9081 | |
| マウス抗ジストロフィン | ライカバイオシステム | ズNCL-DYSB |
参考文献
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al.
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再版と許可
