Intravenösa injektioner i Neonatal Möss
Summary
Djurmodeller av barnsjukdomar kan uppleva tidig debut och aggressivt sjukdomsprogression. Kliniskt relevant terapi leverans till unga musmodeller kan vara tekniskt svårt. Detta protokoll beskriver en icke-invasiv intravenös injektion metod för nyfödda möss inom de två första postnatala dagar i livet.
Abstract
Intravenös injektion är ett kliniskt tillämpligt sätt för att leverera terapeutiska medel. För vuxna gnagare och större djur, intravenösa injektioner är tekniskt möjliga och rutin. Dock kan vissa musmodeller har tidig debut av sjukdomen med en snabb progression som gör administrationen av potentiella terapier svårt. Den tidsmässiga (eller ansiktsbehandling) venen precis främre till öronsnäckorna i möss, och är väl synlig för de två första dagarna efter födseln på vardera sidan av huvudet med hjälp av en dissekera mikroskop. Under det här fönstret, kan den tidsmässiga ven injiceras med volymer upp till 50 pl. Injektionen är säkert och tolereras väl av både valparna och dammarna. En typisk injektionsproceduren är klar inom 1-2 minuter, varefter valpen återförs till hemmaburen. Genom den tredje postnatal dag är venen svårt att visualisera och injektionsproceduren blir tekniskt opålitlig. Denna teknik har använts för leverans av adeno-associerat virus (AAV) vectorer, vilket i sin tur kan ge nästan kroppstäckande, stabilt transgenuttryck för livet av djuret beroende på den virala serotyp valt.
Introduction
Leverans av läkemedel till det centrala nervsystemet (CNS) i musmodeller av barnsjukdomar är fortfarande en utmaning. Möss som modell nyfödda sjukdomstillstånd är undermåliga och utvecklingsmässigt omogna och därför kan vara svårt att direkt injicera i lämpliga strukturer inom CNS. Intravaskulär injektion av terapeutiska medel är en icke-invasiv, väl tolererad metod för att leverera celler, läkemedel, eller virala vektorer till hela kroppen inklusive CNS 1-5 och retina 3,5-9. Tidigare publikationer beskriver tidsmässiga ansikts ven injektion med en transilluminator 10,11, utan en dissektion mikroskop 11,12, eller som kräver två personer för att injicera 10. Den injektionsteknik beskrivs i detta protokoll är fördelaktigt eftersom en enskild individ kan injicera valpar, och ljuskällan för att se den temporala ven inte röra valpen, vilket eliminerar behovet av kirurgtejp eller fastsättning av en valp till en fast ytasåsom en transilluminator 11. Leverans av adeno-associerad viral vektor serotyp 9 (AAV9) i möss ger robust uttryck i neuroner och astrocyter i hela hjärnan och ryggmärgen (fig 1). Intravaskulär leverans av virala vektorer i det ytliga tidsmässiga ansikts ven har ett tillförlitligt används i olika studier på neonatala möss för behandling av barn neuromuskulär sjukdom spinal muskelatrofi (SMA) 2,4,13,14 och slutligen ökade livslängden hos behandlade möss.
Intravaskulär injektion av neonatala möss också effektivt riktar det perifera nervsystemet och perifera organ (Figur 2). Efter injektion av AAV har transduktion av dorsala rotganglier, lever, hjärta, skelettmuskel, lunga, och plexus myentericus av tarmen iakttagits 1,3,6,7,15. Utbredd transduktion av CNS och periferi gör denna metod för injektion idealisk för sjukdomar som kräver global expression aven transgen, såsom Gauchers sjukdom 16 och andra lysosomala lagringssjukdomar 17,18, Batten sjukdom och relaterade neuronala ceroid lipofuscinoses, 19 och Bardet-Biedl syndrom, en genetisk multisystem sjukdom med debut av symtom som förekommer i den tidiga barndomen 20. Intravaskulär injektion i neonatal möss bör också betraktas som en ny metod för modellering hela systemet barnsjukdomar. Denna teknik har översatts till större djurmodeller 5,21 och intravaskulär injektion redan existerar som en kliniskt acceptabel metod för att leverera läkemedel.
Den nuvarande protokollet beskriver en enkel, effektiv metod för att ge medel till neonatala möss genom den ytliga tidsmässiga ansikts ven senast postnatal dag 2. Injektion kan fyllas i av en enda, övade individuellt och tolereras väl av både valparna och dammarna. Valpar upplever minimal stress och återhämta sig snabbt. Importantly kommer lyckad injektion resultera i globala leverans av medlet administreras. Detta protokoll är lämpligt för leverans av virala vektorer, farmaceutiska medel eller celler till nyfödda möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravaskulär tillförsel av medel till CNS eller i hela kroppen är svårt i neonatala musmodeller av sjukdomen. Den beskrivna protokollet är en snabb, relativt icke-invasiv metod för att intravenöst administrera lösningar till neonatal möss med minimala krav på utrustning. Även den tidsmässiga ansikte ven kan ses med blotta ögat, kan injektioner har större noggrannhet med användning av mikroskopet och fiberoptiska ljuskällan, speciellt för en ovan injektor. Intravaskulära injektioner i neonatala möss h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna NINDS, FightSMA och familjer av SMA för ekonomiskt stöd. Segl stöds av NINDS utbildningsbidrag # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Thinpro Insulin Syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10cc, 3/8" needle, 30G, 1 per mouse |
| Evans Blue Dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1X Phosphate Buffered Saline |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting Microscope |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
- Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
- Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
- Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
- Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
- Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
- Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
- Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
- Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
- Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
- Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
- Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
- Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).
