A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
مقاومة الحشرات تشكل مشكلة كبيرة لبرامج مكافحة الملاريا. البعوض على التكيف مع مجموعة واسعة من التغيرات في البيئة بسرعة، مما يجعل مكافحة الملاريا مشكلة منتشرة في كل مكان في البلدان الاستوائية. ظهور مقاومة مبيدات الحشرات السكان يبرر استكشاف مسارات جديدة الهدف المخدرات والمركبات لمكافحة ناقلات البعوض. وتنشأ المخدرات جينية جيدا في أبحاث السرطان، ولكن لا يعرف الكثير عن تأثيرها على الحشرات. وتقدم هذه الدراسة بروتوكول بسيط لفحص الآثار السمية ل3-Deazaneplanocin ألف (DZNep)، وهو دواء جينية التجريبية لعلاج السرطان، على نواقل الملاريا، الأنوفيلة الغامبية. ولوحظ وجود زيادة تعتمد على التركيز في معدل الوفيات وانخفاض في حجم البعوض في غير ناضجة تتعرض لDZNep، في حين خفضت مجمع خصوبة البعوض البالغ النسبية للسيطرة على العلاجات. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك انخفاض تعتمد على المخدرات في S -adenosylhomocysteine (SAH) النشاط هيدرولاز في البعوض بعد التعرض لDZNep قريب للسيطرة على العلاجات. وتوفر هذه البروتوكولات الباحث مع ذلك، خطوة بخطوة إجراء بسيط لتقييم نهايات سمية متعددة للدواء التجريبية و، بدوره، يبرهن على وجود نهج متعدد الشق فريد لاستكشاف الآثار السمية للمخدرات أو مركبات جينية للذوبان في الماء الفائدة ضد البعوض الحامل للمرض والحشرات الأخرى.
الملاريا هو المسؤول عن أكبر عدد من الوفيات المرتبطة حشرة في العالم. تحدث ما يقدر بنحو 219 مليون حالة سنويا في جميع أنحاء العالم، مما أدى إلى ما يقرب من 660،000 حالة وفاة، في المقام الأول في أفريقيا 1. على الرغم من الجهود المتضافرة، تواجه برامج مكافحة الملاريا العديد من التحديات. في حين المعالجة بمبيدات الحشرات ومكونات مفتاح شكل الرش الثمالي داخل المباني البرنامج، ومقاومة للمبيدات الحشرية في السكان المحليين تعرقل هذه الجهود 2. وتعزى الزيادة السريعة في مبيدات الحشرات أسراب البعوض المقاوم إلى حد كبير إلى قدرة البعوض الملاريا على التكيف بسرعة مع التغيرات في بيئتهم واستغلال منافذ مختلفة 3،4،5. للتغلب على الآليات القائمة لمقاومة المبيدات الحشرية، هناك ما يبرر استكشاف أهداف الحشرات رواية ومركبات الجيل القادم. A، خطوة بخطوة بروتوكول بسيط لتحديد مدى فعالية من المبيدات الحشرية التجريبية على مختلف مراحل حياة الملاريا مسوف osquitoes يعزز إلى حد كبير هذه الجهود.
وقد أثبتت الدراسات الدوائية من آثار المخدرات على خطوط الخلايا والنماذج الحيوانية استخدام العقاقير جينية كأداة مفيدة لتحوير علم الوراثة وعلم وظائف الأعضاء من الخلايا والكائنات الحية. مثيلة الحمض النووي وتعديل هيستون نوعان من آليات جينية تؤثر على التعبير الجيني في الكائنات متعددة الخلايا دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسي 6. التعديلات آخر متعدية مثل مثيلة تلعب دورا حاسما في الحفاظ على سلامة الخلوية والتعبير الجيني، ويمكن أن تؤثر العديد من العمليات الأساسية 7،8،9. وقد أبرزت الأبحاث في بعض أنواع الحشرات أهمية علم التخلق في العمليات التي تنطوي على مراحل تكوين البويضات وتنبع صيانة خلية 10، فضلا عن تعويض الجرعة 11. ومع ذلك، لا يزال يتعين استكشاف هذه الجوانب في ناقلات الأمراض. باستخدام مركب لتعديل هذا النظام في البعوض يمكن أن توفر لنا مع فيمشاهد في رواية مسارات الهدف الحشرات. 3-Deazaneplanocin ألف (DZNep) غير معروف مثبط هيستون مثيلة، والتي تم دراستها تأثير على أنواع مختلفة من السرطانات 12،13،14،15،16. DZNep هو للذوبان في الماء المخدرات مستقرة جينية الذي يمنع بشكل غير مباشر هيستون يسين N -methyltransferase (EZH2)، وهو مكون من polycomb القمعي معقدة 2 (PRC2) في خلايا الثدييات. PRC2 يلعب دورا هاما في تنظيم نمو الخلايا الجذعية في الكائنات متعددة الخلايا، وهيستون مثيلة هو جانب رئيسي من PRC2 بوساطة إسكات الجينات. في الفئران المناعة، وقد ثبت الخلايا المعالجة قبل مع DZNep إلى أن تكون أقل مكون للأورام 17. وأصبح يستخدم هذا الدواء لدراسة أمراض أخرى، مثل مرض الكبد الدهني غير الكحولي، والتي EZH2 هو متورط 18. DZNep هو ثابت S -adenosylhomocysteine (SAH) هيدرولاز مثبط 19 و 20. تثبيط النتائج هيدرولاز SAH فيتراكم SAH و، بدوره، يؤدي إلى تثبيط النشاط ناقلة الميثيل عن طريق الحد من المجموعات المانحة الميثيل المتاحة. SAH هو مشتق من الأحماض الأمينية التي تستخدمها العديد من الكائنات الحية، بما في ذلك الحشرات، في ممراتها الأيض. وقد أظهرت دراسة حديثة أن DZNep في الجرعات المنخفضة قد تؤثر على السكون وتأخير التنمية في الحشرات 21.
هنا، يتم تطوير بروتوكول قوي للتحقيق في الآثار المترتبة على مجمع للذوبان في الماء على مختلف مراحل حياة البعوض. الأجزاء الثلاثة لهذا البروتوكول تتضمن تعليمات لدراسة الآثار المترتبة على مجمع للذوبان في الماء على البعوض غير ناضجة، الإناث الرضاعة الدم الكبار، ونشاط انزيم من الذكور البالغين وإناث البعوض. أولا، تم حل DZNep في الماء لدراسة تطوير البعوض غير ناضجة والبقاء على قيد الحياة. يتم تنفيذ ذلك في اثنين من تركيزات لمقارنة أي خلافات تنشأ عن زيادة بنسبة 10 أضعاف في التعرض للمخدرات. لاستكشاف تأثير المخدرات على إناث البعوض الكبار، DZNepيضاف إلى defibrillated الدم الأغنام وتغذية الدم اصطناعيا للإناث. وفي وقت لاحق، يتم فحص نتائج المخدرات على الخصوبة. وأخيرا، يتم تنفيذ انزيم النشاط فحص باستخدام 5،5'-dithiobis- (حمض 2-nitrobenzoic) (DTNB) كمؤشر لتحديد تأثير DZNep على SAH هيدرولاز تثبيط في الذكور البالغين وإناث البعوض. في حين تم تطوير هذا البروتوكول مع بعوضة الملاريا، الأنوفيلة الغامبية، ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة آثار مركبات الفائدة على أي نوع من البعوض أو الحشرات الأخرى. التقنيات بالتفصيل في هذا البروتوكول قد لا يتم تطبيق بكفاءة لدواء مع الذوبان محدود أو معدومة في المياه أو وسائل الإعلام المائي.
هناك عدة خطوات حيوية لنجاح تطبيق هذا البروتوكول. للمقايسة اليرقات، ينبغي الحرص على تسمية بشكل صحيح وتكرار كل تركيز الاختبار. التعشءه عينات الاختبار وإضافة كمية معينة من المخدرات إلى الآبار اختبار كل جزء مهم من هذا التجريبية اقامة. قبل إضافة 2 الثانية الطور يرق?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ | |
DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
Egg dish cups | |||
Filter papers | Fisher | 09-795E | |
Glass feeders | Virginia Tech | ||
Glass tissue homogenizer | |||
Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
Plate reader | Spectramax | M2 | |
SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |