Подготовка Mica Поддерживаемые липидного бислоя за большой размер оптической микроскопии изображений
Summary
Мы представляем способ получения слюды поддерживается бислоев для микроскопия высокого разрешения. Слюда является прозрачным и помещения в атомном масштабе, но редко используется в визуализации из-за трудностей обработки; наша подготовка приводит к отложению даже слюды лист, а также снижает материал, используемый в процессе подготовки двухслойной.
Abstract
Поддерживаемые липидного бислоя (SLBS) широко используются в качестве модели для исследования мембранных свойств (разделение фаз, кластеризации, динамика) и его взаимодействия с другими веществами, такими как наркотики или пептидов. Однако SLB характеристики отличаются в зависимости от поддержки используется.
Обычно используемые методы SLB изображений и измерений одной молекулы флуоресцентной микроскопии, ФТС и атомно-силовой микроскопии (АСМ). Поскольку большинство оптических изображений исследования проводятся на стеклянной подложке, в то время как АСМ требует чрезвычайно плоскую поверхность (как правило, слюды), результаты этих методов не может сравниться непосредственно, так как заряд и гладкости свойства этих материалов сильно влияют диффузии. К сожалению, высокий уровень ловкости рук, необходимых для резки и склеивания тонкие ломтики слюды на стекло представляет собой препятствие для рутинного применения слюды для подготовки SLB. Хотя это было бы методом выбора, например подготовлены слюдыповерхности часто тратятся неравномерно (волнистые) и трудно изображения, особенно с малым рабочим расстоянием, высокие линз числовой апертурой. Здесь мы представляем простой и воспроизводимый способ получения тонких плоских слюды поверхности для липидов осаждения везикул и подготовки SLB. Кроме того, наша заказ камера требует только очень небольшие объемы пузырьков для формирования SLB. Общие процедура приводит к эффективной, простой и недорогой производства высококачественных липидный бислой поверхностей, которые сопоставимы с используемыми в АСМ исследований.
Introduction
Общая цель настоящего Протокола заключается, чтобы показать способ получения слюды поверхности для изображения с высоким разрешением слюдяных поддерживается липидного бислоя (SLBS) с использованием оптического общей флуоресценции внутреннего отражения микроскопии (TIRFM) или конфокальной микроскопии, который также может быть в сочетании с атомно-силовой микроскопии (AFM).
SLBS являются широко используется модель для многочисленных исследований липидного кластеризации, разделение фаз, динамики компонентов двухслойных или их взаимодействия с пептиды, белки или других соединений 1-5. Различные подложки могут быть использованы для формирования SLB (т.е. стекло, слюда, диоксид кремния, полимеры) в зависимости от характера исследования 4,6-8. Типичные исследования мембранных полагаться на методы визуализации микроскопии на основе, например, TIRFM и АСМ. Таким образом, для работы с изображениями TIRFM, поверхность стекла является типичным выбором, потому что стекло прозрачно. Подготовка стекла относительно легко, и качество результатов в первую очередьопределяется тщательной очистки поверхности перед осаждением липидных везикул. АСМ из-за своей резолюции высокой осевой требуется слюды поверхности. Мика является силикатный минерал, с близко к совершенной базальной декольте. Таким образом, свежесколотой слюда атомарно плоской, позволяя наблюдать перепада высот мембранных даже в суб-нанометровом масштабе 9.
Диффузионные исследования с использованием таких методов, как флуоресценции корреляционной спектроскопии (FCS), одной молекулы отслеживания (SMT), и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) показал однако, что динамика липидной мембраны в значительной степени зависят от типа поверхности, на которую они оседают, в результате чего стекло и слюда может дать самые различные результаты 10,11. Эти различия относятся не только коэффициентов диффузии мембранных зондов, но и обнаружение отдельных популяций частиц, диффундирующих с разной скоростью, и, возможно переключение между различными государствами.
Таким образом,Прямое сравнение результатов, полученных с помощью TIRFM и АСМ методы зачастую проблематично, если же поверхность (в данном случае слюды) не используется. Хотя есть некоторые исследования, где TIRFM и АСМ двухслойная изображений проводилось на той же поверхности слюды 12,13, слюда редко используется для оптической микроскопии, в основном из-за проблем обработки. Подготовка Мика требуется резка вручную на тонкие листовок, которые затем приклеены к покровного стекла с использованием оптического клея 12. Этот метод, однако, требуется некоторая практика, чтобы достичь удовлетворительных результатов. Кроме того, поверхности, полученные часто волнистые и густые, что делает их трудно использовать с низким рабочим расстоянием, высокие линз числовой апертурой.
Слюды поверхности, полученные, как описано в данном протоколе очень тонкие (~ 220 мкм, включая толщину покровного 170 мкм) и очень плоским, избегая "волнистость", которая имеет решающее значение для успешного изображений с высоким разрешением. Они могут быть использованыдля TIRFM или конфокальной установок. Кроме того, те же образцы могут быть переданы в АСМ, и даже отображаемого одновременно с TIRFM / конфокальной и АСМ. Сочетание этих двух методов позволяет прямую зависимость диффузии поведения с двухслойной мембраной структуры 14. Потому слюды поверхности свежесколотой, они чистые и не требуют затрат времени, плохо воспроизводимы, и потенциально опасные процедуры очистки (очистки стекла протоколы обычно включают химикаты, такие как решения Piranha, серная кислота, натрия / гидроксид калия). Монтаж небольшую камеру, также описанного в протоколе, уменьшает объем пузырьков, необходимых для эффективного образования двухслойной до менее чем 50 мкл. Наконец, весь процесс поверхностного монтажа не отнимает много времени (подготовка занимает менее 30 мин), и не требует высокой степени мастерства ручной, так же как обычные расщепление слюды и склеивание.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает способ получения гладких и тонких поверхностей слюды для липидов осаждения двухслойной и высоким разрешением. Методика требует минимальных ручной труд, ограниченные в основном к тщательной разборки бутерброд стекло-слюда-стекло (шаг 2.8), которая имеет решающе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют подтверждений.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50mm – No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -. C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane–a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
