Udarbejdelse af Mica Understøttet lipiddobbeltlagenes for High Resolution optisk mikroskopi Imaging

Summary

Vi præsenterer en fremgangsmåde til fremstilling af glimmer understøttet lipiddobbeltlag for høj opløsning mikroskopi. Mica er gennemsigtig og fladt på en atomar skala, men sjældent brugt i billedbehandling på grund af håndtering af problemer; vores forberedelse resulterer i mere aflejring af glimmer ark og reducerer materiale anvendt i dobbeltlaget præparat.

Abstract

Understøttede lipid dobbeltlag (SLBs) er almindeligt anvendt som en model til at studere membranproteiner egenskaber (fase separation, klyngedannelse, dynamik), og dens interaktion med andre forbindelser, såsom narkotika eller peptider. Men SLB egenskaber varierer afhængigt af den støtte, der anvendes.

Almindeligt anvendte teknikker til SLB billeddannelse og målinger er enkelt molekyle fluorescens mikroskopi, FCS og atomic force mikroskopi (AFM). Fordi de fleste optiske billeddiagnostiske undersøgelser foretages på et glas support, mens AFM kræver en ekstremt flad overflade (generelt glimmer), kan resultaterne fra disse teknikker ikke sammenlignes direkte, da op-og glathed egenskaber af disse materialer stærk indflydelse diffusion. Desværre højt håndelag nødvendige for skæring og limning tynde skiver af glimmer til objektglasset viser en forhindring for rutinemæssig brug af glimmer SLBs forberedelse. Selv om dette ville være den foretrukne metode, f.eks fremstillet glimmeroverflader ofte ender med at blive ujævn (bølget) og vanskelige at billedet, især med lille arbejdsgruppe afstand, høj numerisk blænde objektiver. Her præsenterer vi en enkel og reproducerbar metode til fremstilling af tynde, flade glimmer overflader til lipidvesikel aflejring og SLB forberedelse. Derudover vores specialfremstillede kammer kræver kun meget små mængder af vesikler til SLB dannelse. De overordnede procedure resulterer i en effektiv, enkel og billig produktion af høj kvalitet lipiddobbeltlaget overflader, der er direkte sammenlignelige med dem, der anvendes i AFM undersøgelser.

Introduction

Det overordnede mål med denne protokol er at vise en metode til fremstilling af glimmer overflader for høj opløsning billeddannelse af glimmer understøttede lipid dobbeltlag (SLBs) bruger optisk total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM) eller konfokal mikroskopi, som også kunne kombineres med atomic force mikroskopi (AFM).

SLBs er en udbredt model til utallige undersøgelser af lipid klyngedannelse, faseadskillelse, dynamik dobbeltlagsmembraner komponenter eller deres interaktion med peptider, proteiner eller andre forbindelser ^1-5. Forskellige substrater kan anvendes til SLB dannelse (dvs. glas, glimmer, siliciumdioxid, polymerer), afhængigt af arten af undersøgelsen ^4,6-8. Undersøgelser Typiske membran stole på mikroskopi-baserede imaging teknikker, såsom TIRFM og AFM. Således TIRFM billeddannelse, en glasoverflade er et typisk valg, fordi glas er gennemsigtigt. Fremstilling af glas er forholdsvis let, og kvaliteten af ​​de resultater, primærtbestemmes ved grundig rengøring af overflader før aflejring af lipidvesikler. AFM grund af sin høje aksiale opløsning kræver glimmer overflader. Mica er et silikat mineral, med tæt på perfekt basal spaltning. Således frisk kløvet glimmer er atomically flad, så observation af membran højdeforskelle selv på sub-nanometer skala ^9.

Diffusion undersøgelser ved hjælp af metoder som fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), enkelt molekyle sporing (SMT), og fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) viste dog, at lipid membran dynamik afhænger i høj grad af den type overflade, på hvilken de er deponeret, hvorved glas og glimmer kan give vidt forskellige resultater ^10,11. Disse forskelle omfatter ikke kun diffusionskoefficienterne af membranen sonder, men også påvisning af separate populationer af partikler diffunderer med forskellige satser, og muligvis skifte mellem forskellige stater.

Såledesden direkte sammenligning af resultater opnået ved brug TIRFM og AFM teknikker er ofte problematisk, med mindre den samme overflade (i dette tilfælde glimmer) er anvendt. Selvom der er nogle undersøgelser, hvor TIRFM og AFM tolags imaging blev udført på samme glimmer overflade ^12,13 er glimmer sjældent bruges til optisk mikroskopi, hovedsagelig på grund af problemer med papirhåndtering. Glimmer forberedelse kræver skæring med hånden i tynde foldere, som derefter limet til dækglasset bruger optisk lim ^12. Denne metode kræver dog lidt øvelse at opnå tilfredsstillende resultater. Desuden overfladerne opnåede ofte bølget og tyk, hvilket gør dem svære at bruge med lav arbejdstid afstand, høj numerisk blænde objektiver.

Glimmer overflader fremstillet som beskrevet i denne protokol er meget tynde (~ 220 um, herunder dækglasset tykkelse på 170 um) og ekstremt fladt, så man undgår "waviness", som er afgørende for en vellykket høj opløsning billeddannelse. De kan brugesfor TIRFM eller konfokal opsætninger. Desuden kan de samme prøver overføres til AFM, og selv afbildes samtidigt med TIRFM / konfokal og AFM. Ved at kombinere disse to teknikker giver mulighed for direkte korrelation mellem diffusion adfærd med dobbeltlaget membran struktur ^14. Fordi glimmer overflader er frisk spaltes, de er rene og ikke kræver tidskrævende, dårligt reproducerbar, og potentielt farlige rengøringsprocedurer (glas rengøring protokoller normalt omfatte kemikalier såsom Piranha løsning, svovlsyre, natrium / kalium-hydroxid). Montering af et lille kammer, også beskrevet i protokollen, reducerer mængden af ​​vesikler, der er nødvendige for en effektiv dobbeltlagsformation til mindre end 50 pl. Endelig er hele processen med overfladen samling er ikke tidskrævende (forberedelse tager mindre end 30 minutter), og kræver ikke en høj grad af manuel dygtighed, som gør konventionelle glimmer spaltning og limning.

Protocol

1.. Mica og Slides Forberedelse Sted nr. 1 ½ (0,17 mm) dækglas i farvning rack. Soniker i 30 minutter i 2% vaskemiddel ved 60 ° C. Vask 20 gange med deioniseret vand. Fjern slides med pincet og blæs tør med trykluft eller nitrogen. Skær glimmer ark i 10 x 10 mm kvadratiske stykker med saks eller barberblad. Skær hver glimmer stykke ind i 2-3 tyndere foldere hjælp barberblad. BEMÆRK: Dette trin kræver brug af skarpe klinge. <p class="…

Representative Results

Spredningen opførsel af fluorescerende lipid sonder i SLBs er forskellig afhængig af underlaget. TIRFM kombineret med SMT teknik er en værdifuld metode til at visualisere partikel bevægelser og ekstrahere deres diffusionskoefficienter. Enkelt molekyle signaler af en sphingomyelin-ATTO647N probe diffunderer i DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) dobbeltlag understøttet på glas og glimmer er vist på vedlagte animerede figur. Glimmer overflade blev fremstillet ifølge protokollen præsenteret her….

Discussion

Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af glatte og tynde glimmer overflader til lipiddobbeltlag deposition og høj opløsning. Teknikken kræver minimal manuelle færdigheder, begrænset meste til omhyggelig adskillelse af glas glimmer sandwich (trin 2.8), som er afgørende for at opnå en høj kvalitet glimmer overflade. Inspektion af frisk spaltet glimmer altid påkrævet på dette tidspunkt, da det er muligt for glimmer at løsne sig fra den optiske lim uden spalte, der forlader udsatte områder…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50mm – No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power