मीका की तैयारी उच्च संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए लिपिड bilayers समर्थित
Summary
हम उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए अभ्रक समर्थित लिपिड bilayers तैयारी का एक तरीका मौजूद है. मीका एक परमाणु पैमाने पर पारदर्शी और फ्लैट है, लेकिन शायद ही कभी क्योंकि कठिनाइयों से निपटने की इमेजिंग में इस्तेमाल किया; हमारी तैयारी अभ्रक चादर का भी बयान में यह परिणाम है, और bilayer तैयारी में प्रयुक्त सामग्री कम कर देता है.
Abstract
समर्थित लिपिड bilayers (SLBs) व्यापक रूप से झिल्ली गुण (चरण जुदाई, क्लस्टरिंग, गतिशीलता) और ऐसी दवाओं या पेप्टाइड्स के रूप में अन्य यौगिकों, के साथ अपनी बातचीत के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि SLB विशेषताओं का इस्तेमाल किया समर्थन पर निर्भर करती है.
SLB इमेजिंग और माप के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की तकनीक एक अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, FCS और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) कर रहे हैं. AFM एक बेहद सपाट सतह (आमतौर पर अभ्रक) की आवश्यकता है, जबकि सबसे अधिक ऑप्टिकल इमेजिंग अध्ययन, एक गिलास समर्थन पर बाहर किया जाता है क्योंकि इन सामग्रियों के प्रभारी और चिकनाई गुण जोरदार प्रसार को प्रभावित के बाद से, इन तकनीकों से परिणाम, सीधे तुलना नहीं की जा सकती है. दुर्भाग्य से, कांच स्लाइड को काटने और अभ्रक के पतले स्लाइस gluing के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता के उच्च स्तर SLB तैयारी के लिए अभ्रक का नियमित प्रयोग करने के लिए एक बाधा प्रस्तुत करता है. इस चुनाव की विधि, इस तरह तैयार अभ्रक होगा हालांकिसतहों अक्सर विशेष रूप से छोटे काम दूरी, उच्च संख्यात्मक एपर्चर लेंस के साथ, असमान (लहराती) और छवि के लिए मुश्किल खत्म किया जा रहा. यहाँ हम लिपिड पुटिका बयान और SLB तैयारी के लिए पतली, फ्लैट अभ्रक सतहों की तैयारी के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रस्तुत करते हैं. इसके अतिरिक्त, हमारे कस्टम बनाया चैम्बर SLB गठन के लिए vesicles के केवल बहुत छोटी मात्रा की आवश्यकता है. AFM पढ़ाई में इस्तेमाल उन लोगों को सीधे तुलना कर रहे हैं कि उच्च गुणवत्ता लिपिड bilayer सतहों, कुशल सरल और सस्ती उत्पादन में समग्र प्रक्रिया का परिणाम है.
Introduction
वर्तमान प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य भी परमाणु शक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है जो ऑप्टिकल कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) या confocal माइक्रोस्कोपी, का उपयोग अभ्रक समर्थित लिपिड bilayers (SLBs) के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अभ्रक सतहों की तैयारी के लिए एक विधि को दिखाने के लिए है माइक्रोस्कोपी (AFM).
SLBs लिपिड क्लस्टरिंग, चरण जुदाई, पेप्टाइड्स, प्रोटीन या अन्य यौगिकों 1-5 से bilayer घटकों या उनकी बातचीत की गतिशीलता के कई अध्ययनों के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल हैं. विभिन्न substrates SLB गठन अध्ययन 4,6-8 की प्रकृति पर निर्भर करता है (यानी कांच, अभ्रक, सिलिकॉन डाइऑक्साइड, पॉलिमर) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ठेठ झिल्ली पढ़ाई ऐसी TIRFM और AFM के रूप में माइक्रोस्कोपी आधारित इमेजिंग तकनीक, पर भरोसा करते हैं. कांच पारदर्शी है क्योंकि इस प्रकार, TIRFM इमेजिंग के लिए एक कांच की सतह एक विशिष्ट स्थान है. कांच की तैयारी अपेक्षाकृत आसान है, और परिणामों की गुणवत्ता में मुख्य रूप से हैपूर्व लिपिड vesicles के बयान को सफाई पूरी तरह से सतह से निर्धारित होता. इसकी उच्च अक्षीय संकल्प की वजह से AFM अभ्रक सतहों की आवश्यकता है. मीका सही बेसल दरार के पास से, एक सिलिकेट खनिज है. इस प्रकार, हौसले से cleaved अभ्रक भी उप नैनोमीटर पैमाने पर 9 झिल्ली ऊंचाई मतभेदों के अवलोकन की अनुमति, atomically फ्लैट है.
ऐसे प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस), ट्रैकिंग एक अणु (श्रीमती), और photobleaching (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली जैसे तरीकों का उपयोग प्रसार पढ़ाई कि लिपिड झिल्ली गतिशीलता वे जमा कर रहे हैं पर जो सतह के प्रकार, जिससे कांच पर भारी निर्भर करती है, लेकिन पता चला और अभ्रक व्यापक रूप से अलग परिणाम 10,11 दे सकते हैं. इन मतभेदों झिल्ली जांच के प्रसार गुणांक, लेकिन यह भी अलग दरों के साथ diffusing कणों की अलग आबादी का पता लगाने, और संभवतः विभिन्न राज्यों के बीच स्विच करने के लिए न केवल शामिल हैं.
इस प्रकार,एक ही सतह (इस मामले अभ्रक में) का उपयोग किया जाता है जब तक कि TIRFM और AFM तकनीक का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के प्रत्यक्ष तुलना, अक्सर समस्याग्रस्त है. TIRFM और AFM bilayer इमेजिंग एक ही अभ्रक सतह 12,13 पर आयोजित किया गया, जहां कुछ अध्ययन कर रहे हैं हालांकि, अभ्रक शायद ही कभी क्योंकि ज्यादातर समस्याओं से निपटने के, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए प्रयोग किया जाता है. मीका तैयारी तो ऑप्टिकल चिपकने वाला 12 का उपयोग coverslip से चिपके हैं जो पतली पत्रक, में हाथ से काटने की आवश्यकता है. इस विधि हालांकि संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता है. इसके अलावा, प्राप्त सतहों उन्हें मुश्किल कम काम दूरी, उच्च संख्यात्मक एपर्चर लेंस के साथ उपयोग करने के लिए कर रही है, अक्सर लहराती और मोटी हैं.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में तैयार मीका सतहों बहुत पतले होते हैं (170 माइक्रोन की coverslip मोटाई सहित ~ 220 माइक्रोन,) और अत्यंत फ्लैट, सफल उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है जो "तरंगमयता", परहेज. उन्होंने इसका इस्तेमाल किया जा सकता हैTIRFM या confocal सेटअप के लिए. इसके अलावा, एक ही नमूने AFM को हस्तांतरित किया जा सकता है, और यहां तक कि TIRFM / confocal और AFM के साथ एक साथ imaged. इन दो तकनीकों का मेल bilayer झिल्ली संरचना के साथ 14 प्रसार व्यवहार का सीधा संबंध अनुमति देता है. अभ्रक सतहों हौसले से चिपके रहते हैं, क्योंकि वे साफ कर रहे हैं और (कांच सफाई प्रोटोकॉल आमतौर पर इस तरह पिरान्हा समाधान, सल्फ्यूरिक एसिड, सोडियम पोटेशियम / हाइड्रॉक्साइड के रूप में रसायन शामिल हैं) समय लेने, खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, और संभावित खतरनाक सफाई प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है. भी प्रोटोकॉल में वर्णित एक छोटे से कक्ष के बढ़ते, कम से कम 50 μl के लिए प्रभावी bilayer गठन के लिए आवश्यक vesicles की मात्रा कम कर देता है. अंत में, सतह विधानसभा की पूरी प्रक्रिया में समय लगता पारंपरिक अभ्रक दरार और gluing रूप में करता है, (तैयारी कम से कम 30 मिनट लगते हैं), और मैनुअल कौशल के एक उच्च डिग्री की आवश्यकता नहीं है नहीं है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल लिपिड bilayer बयान और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए चिकनी और पतली अभ्रक सतहों की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन करता है. तकनीक ज्यादातर एक उच्च गुणवत्ता अभ्रक सतह प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक कोई पावती है.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50mm – No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -. C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane–a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
