Utarbeidelse av Mica Støttet Lipid bilayers for High Resolution Optical Mikros Imaging

Summary

Vi presenterer en fremgangsmåte for fremstilling av glimmer støttes lipid-dobbeltlag for høy oppløsning mikroskopi. Glimmer er transparent og flatt på en atomskala, men lite brukt i avbildning på grunn av håndtering av vanskeligheter; vårt preparat resulterer i jevn avsetning av glimmer-ark, og reduserer det materiale som brukes i dobbeltsjikt preparatet.

Abstract

Støttede lipid bilayers (SLBs) er mye brukt som modell for å studere membranegenskaper (fase separasjon, clustering, dynamikk) og dets interaksjon med andre forbindelser, for eksempel narkotika eller peptider. Men SLB egenskaper varierer avhengig av støtte brukes.

Vanlige teknikker for SLB bildebehandling og målinger er enkelt molekyl fluorescens mikroskopi, FCS og atomic force mikroskopi (AFM). Fordi de fleste optiske imaging studier er utført på et glass-støtte, mens AFM krever en ekstremt flat overflate (vanligvis glimmer), kan resultatene fra disse teknikkene ikke sammenlignes direkte, ettersom lade og jevnhet egenskapene til disse materialene sterkt påvirke diffusjon. Dessverre, det høye nivået av manuell dyktighet for skjæring og liming tynne skiver av glimmer til glass-slide presenterer et hinder til rutinemessig bruk av glimmer for SLB forberedelse. Selv om dette ville være den foretrukne metode, for eksempel fremstilt glimmeroverflater ofte ende opp med å bli ujevnt (bølget) og vanskelig å image, spesielt med liten arbeidsavstand, høy numerisk blenderåpning. Her presenterer vi en enkel og reproduserbar metode for å forberede tynne, flate glimmer overflater for lipidvesikkel deponering og SLB forberedelse. I tillegg krever vår skreddersydde kammer bare svært små mengder vesikler for SLB formasjon. Den generelle fremgangsmåte resulterer i en effektiv, enkel og billig produksjon av høykvalitets lipid-dobbeltlag-flater som er direkte sammenlignbare med de som brukes i AFM studier.

Introduction

Det overordnede målet for den nåværende protokollen er å vise en metode for å forberede glimmer overflater for høyoppløselig avbildning av glimmer støttet lipid dobbeltlag (SLBs) ved hjelp av optisk total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) eller konfokalmikroskopi, som også kan kombineres med atom-kraft mikroskopi (AFM).

SLBs er en mye brukt modell for en rekke studier av lipid clustering, faseseparasjon, dynamikk tolagskomponentene eller deres interaksjon med peptider, proteiner eller andre forbindelser ^1-5. Forskjellige substrater kan benyttes til SLB-formasjon (dvs. glass, glimmer, silisiumdioksid, polymerer), avhengig av arten av studien ^4,6-8. Typiske studier membran avhengige av mikrosbasert avbildningsteknikker, som for eksempel TIRFM og AFM. Således, for TIRFM avbildning, er en glassoverflate et typisk valg fordi glass er gjennomsiktig. Fremstilling av glass er forholdsvis enkel, og kvaliteten av resultatet er først og fremstbestemmes ved grundig overflaterensing før avsetning av lipid-vesikler. AFM på grunn av sin høye aksial oppløsning krever glimmer overflater. Mica er et silikat mineral, med nær perfekt basal cleavage. Således er den ferske spaltes glimmer atomically flat, slik at observasjon av membranhøydeforskjeller selv ved den sub-nanometerskala ^9.

Diffusjon studier ved hjelp av fremgangsmåter slik som fluorescens-korrelasjonsspektroskopi (FCS), enkelt molekyl sporing (SMT), og fluorescens restitusjon etter photobleaching (FRAP) viste imidlertid at lipid membran dynamikk avhenge sterkt av den type overflate hvorpå de er avsatt, hvorved glasset og glimmer kan gi vidt forskjellige resultater ^10,11. Disse forskjellene er ikke bare de diffusjonskoeffisienter i membranen, sonder, men også påvisning av separate bestander av partikler Diffusorelementene med ulike priser, og muligens bytte mellom ulike stater.

Såledesden direkte sammenligning av resultatene som oppnås ved bruk av TIRFM og AFM teknikker er ofte problematisk, med mindre den samme overflaten (i dette tilfellet glimmer) brukes. Selv om det er noen studier hvor TIRFM og AFM bilags bildebehandling ble gjennomført på samme glimmer overflate ^12,13, er glimmer sjelden brukt for optisk mikroskopi, hovedsakelig på grunn av problemer med håndteringen. Mica forberedelse krever skjæring for hånd i tynne hefter, som deretter limt til dekkglass ved hjelp av optisk lim ^12. Denne metoden krever imidlertid litt øvelse for å oppnå tilfredsstillende resultater. Videre er de flater som oppnås er ofte bølget og tykk, noe som gjør dem vanskelige å bruke en lav arbeidsavstand, høy numerisk blenderåpning.

Mica overflater fremstilt som beskrevet i denne protokollen er svært tynn (~ 220 mikrometer, inkludert dekk tykkelse på 170 mikrometer) og ekstremt flat, unngå "waviness", noe som er avgjørende for vellykket høy oppløsning. De kan benyttesfor TIRFM eller confocal oppsett. Dessuten kan de samme prøvene bli overført til AFM, og avbildes også samtidig med TIRFM / confocal og AFM. Ved å kombinere disse to teknikkene tillater direkte korrelasjon av diffusjon atferd med dobbeltmembranen struktur ^14. Fordi glimmer overflater er ferske kløyvde, de er rene og ikke krever tidkrevende, dårlig reproduserbar, og potensielt farlige rengjøringsprosedyrer (glass rengjøring protokoller inkluderer vanligvis kjemikalier som Piranha løsning, svovelsyre, natrium / kaliumhydroksid). Montering av et lite kammer, som også er beskrevet i protokollen, reduserer volumet av vesikler som kreves for effektiv bilagsdannelse mindre enn 50 pl. Til slutt er hele prosessen med overflateenheten ikke er tidkrevende (fremstillingen tar mindre enn 30 min), og krever ikke en høy grad av manuell dyktighet, og det gjør konvensjonell glimmer spalting og liming.

Protocol

En. Mica og Slides Forberedelse Sted nr 1 ½ (0,17 mm) Dekk inn farging rack. Sonicate i 30 minutter i 2% vaskemiddel ved 60 ° C. Vask 20 ganger med avionisert vann. Fjern lysbilder ved hjelp av pinsett og blås tørt med trykkluft eller nitrogen. Skjær glimmer ark i 10 x 10 mm kvadratiske brikker bruker saks eller barberblad. Skjær hver glimmer stykke inn 2-3 tynnere brosjyrer ved hjelp av barberblad. MERK: Dette trinnet krever bruk av skarp kniv. <…

Representative Results

Spredningen oppførsel av fluorescerende lipid sonder i SLBs er forskjellig avhengig av underlaget. TIRFM kombinert med SMT teknikken er en verdifull metode for visualisering av partikkelbevegelser og ekstrahere deres diffusjonskoeffisienter. Enkelt molekyl signaler om en Sphingomyelin-ATTO647N probe spre i en DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) bilayer støttes på glass og glimmer er vist på vedlagte animerte figuren. Den glimmer overflate ble fremstilt i henhold til protokollen som er presentert…

Discussion

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av jevne og tynne glimmer overflater for lipid-dobbeltlag avsetning og høy oppløsning. Teknikken krever minimal håndlag, begrenset hovedsakelig til forsiktig demontering av glass-glimmer-glass-sandwich (trinn 2.8), som er kritisk for å oppnå en høy kvalitet glimmer overflate. Inspeksjon av ferskt spaltes glimmer er alltid nødvendig på dette tidspunkt, siden det er mulig for glimmeret til å løsne fra den optiske klebemiddel uten å spalte, slik at u…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50mm – No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power