Method Article

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

DOI:

10.3791/52085

⸱

December 21st, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest University Health Sciences, 2The Ritchie Centre, Monash Institute of Medical Research, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אפיתל מי שפיר אנושיים (hAECs) באמצעות ריאגנטים ללא מוצרים מן החי בהתאם להנחיות הנוכחיות של תנאי ייצור נאותים (cGMP).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי אפיתל מי שפיר אנושיים (hAECs) שמקורם בקרומי מי שפיר מונחים או מוקדמים משכו תשומת לב של חוקרים וקלינאים כמקור פוטנציאלי לתאים לרפואה רגנרטיבית. הסיבה לעניין זה היא עדויות לכך שלתאים אלה יש יכולת התמיינות רב-פוטנטית גבוהה, אימונוגניות נמוכה ותפקודים אנטי דלקתיים. תכונות אלה הניעו חוקרים לחקור את הפוטנציאל של hAECs לשמש לטיפול במגוון מחלות והפרעות במחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים בהצלחה רבה.

hAECs מצאו יישום נרחב לטיפול במגוון מחלות והפרעות. יישומים קליניים פוטנציאליים של hAECs כוללים טיפול בשבץ מוחי, טרשת נפוצה, מחלות כבד, סוכרת ומחלות ריאה כרוניות ואקוטיות. התקדמות מניסויים פרה-קליניים בבעלי חיים לניסויים קליניים דורשת סטנדרט גבוה יותר של בקרת איכות ובטיחות למוצרי טיפול תאי. משיקולי בטיחות ובקרת איכות, עדיף שפרוטוקולי בידוד תאים ישתמשו בריאגנטים נטולי מוצרים מן החי.

פיתחנו פרוטוקולים המאפשרים לחוקרים לבודד, לשמר בהקפאה ולתרבית hAECs באמצעות ריאגנטים נטולי מוצרים מן החי. היתרון בשיטה זו הוא שניתן לבודד, לאפיין, לשמר בהקפאה ולתרבת תאים אלה ללא סיכון של העברת פתוגנים בעלי חיים שעלולים להזיק לבני אדם, תוך שמירה על תפוקת תאים מתאימה, כדאיות ופוטנציאל גדילה. עבור חוקרים העוברים ממחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים לניסויים קליניים, מתודולוגיות אלה יאיצו מאוד את האישור הרגולטורי, יפחיתו סיכונים וישפרו את איכות אוכלוסיית התאים הטיפוליים שלהם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים המופקים ממקורות סביב הלידה, כגון השליה, שליה קרומים, חבל טבור ומי שפיר שמשכו את תשומת לב של חוקרים וקלינאים כמקור פוטנציאלי של תאים לרפואת רגנרטיבית 1,2. הסיבה לעניין זה היא כי סוגים אלה תא כל יש מידה מסוימת של גמישות ויכולת המערכת החיסונית 3, תכונות שהן יסוד ליישומים הטיפוליים הפוטנציאל שלהם.

hAECs היא אוכלוסייה הטרוגנית אפיתל שניתן להפיק מקרום amnion טווח או מראש טווח 4, מתן מקור פוטנציאלי בשפע של חומר תאי משובי. התכונות שהופכות את hAECs מושך כטיפול תאי כוללות multipotency שלהם, immunogenicity הנמוך, ותכונות אנטי דלקתיות....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: Placentae יש לאסוף מהריונות בריאים סינגלטון, עם העדפה לניתוחים קיסריים אלקטיביים טווח. בכתב, הסכמה מדעת יש לתת לאיסוף השליה שלהם. ועדת האתיקה במחקר האנושית הרלוונטית שלך צריך אישור כל האיסוף ושימוש ברקמות אנושיות.

1. בידוד של תאי אפיתל amnion

  1. מניחים את השליה על גבי משטח סטרילי בתוך ארון בטיחות ביולוגי ברמה השנייה.
  2. באמצעות הנקס סטרילי תמיסת מלח מאוזן (HBSS), לשטוף כמה שיותר דם ככל האפשר ממשטח השליה ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר הליך זה ואחריו בצורה נכונה, תשואה ממוצעת של 120 מ'hAECs צריכה להיות צפויה, עם מגוון טיפוסי של 80-160,000,000 תאים. מתשואות אלה, ניתן לצפות כדאיות ממוצעת של 83 ± 4%. הגידול בתשואה הממוצעת והכדאיות נמוכה במקצת בשיטה הקלינית יכולים להיות בגלל פעילות טריפסין גבוהה מהמוצר המופק מבעלי החיים, ואולי גם בשל היעדרם של חלבונים בסרום. יש לי hAECs המבודד פרופיל פני תא ממוצע של תאים חיוביים EpCAM 92% עם <תאים חיוביים סמן mesenchymal 1% CD90, CD105. סמנים אלה נבחרו בשל ייחודם ל24,25.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם מספר פרמטרים קריטיים שיכול להשפיע באופן משמעותי בהצלחתה של מתודולוגיה זו. אחסון של השליה או amnion עד 3 שעות לפני הבידוד של hAECs עשוי להיות רצוי למטרות לוגיסטיים או תזמון, אולם מומלץ שרקמת מעובד בהקדם האפשרי. אם רקמה היא להיות מאוחסנת, מומלץ כי אחסון להתבצע הבא לנתיחה ושטיפה של קרום amnion. ניתן לאחסן amnion באנטיביוטיקת HBSS סטרילית המכילה על 4 מעלות צלזיוס, אולם כדאיות תא יכולות יפחתו עם זמן אחסון ממושך. אנחנו, ואחרים מצאנו השתנות בתשואת תא ואת הכדאיות, וכדי למזער את ההשתנ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים בתמיכה כספית מתוכנית התמיכה בתשתיות תפעוליות של ממשלת ויקטוריה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ערכת
מגש הפשטהפישר סיינטיפיק13-361B
ליברטי חבישת מלקחיים, מחודד 13 ס"מפישר סיינטיפיקS17329 
מספריים - חד / קהה ישרפישר סיינטיפיקNC0562592 
כפפות לטקס סטריליות פישר סיינטיפיק19-014-643 
ביגוד
מגן ביגוד מגן (שמלה)U-lineS-15374-M
שמלות בידודU-lineS-15374-M
כפפות לטקס סטריליות פישר סיינטיפיק19-014-643 
מסכת פנים לשימוש כלליCardinal HealthAT7511
BonnetsMedlineCRI1001
נעליים מכסהU-lineS-7873W
מדיה וריאגנטים
הנקס' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)Life Technologies14175095ללא סידן או מגנזיום
TrypZean (ממקור מן החי; טריפסין רקומביננטי חופשי)סיגמא אולדריץ'T3449
מעכב טריפסין פולי סויה  1 גרם/50 מ"לסיגמא אולדריץ'T6522
Cryostor CS5BioLife Solutions205102
מגיב כחול טריפןLife Technologies15250-061
Anti-EpCam-PEMiltenyi Biotec130 - 091-253
PE-isotype שליטהMiltenyi Biotec130-098-845
Anti-CD90-PeCy5BD Pharmingen555597
PeCy5-isotype controlBD Pharmingen557224
Anti-CD105-APCBD Pharmingen562408
APC-isotype controlBD Pharmingen340754
קולגן מסוג VISigma AldrichC7521
חומרים
50 מ"ל פיפטה מדורגתBD/Falcon356550
10 מ"ל פיפטה מדורגתBD/Falcon356551
5 מ"ל פיפטה מדורגתBD/Falcon356543
50 מ"ל שפופרות בזBD/Falcon352070
15 מ"ל BD/Falcon352096
צלחות פטרי 15 ס"מקורנינג351058
70 μ מסנני mBD/Falcon352350
0.22 μ m מסנניםMilliporeSLGV033RS
1 מ"ל קצות פיפטה פישרברנד02-707-401
200 μ l טיפים לפיפטהפישרברנד02-707-409
20 מ"ל מזרקBD/רפואי309661
מרית פלסטיקפישר סיינטיפיק14-245-97 
סירת שקילה מפלסטיקפישר סיינטיפיק02-202-102 
בקבוקוני קריוNuncציוד
מר פרוסטיפישר סיינטיפיקA451-4 
ארון
איסוףמתכלים 377267 ביולוגי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
  2. Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Amnion Epithelial CellsAmnion Membrane IsolationAnimal Product Free ReagentsFlow Cytometric AnalysisCryopreservation ProtocolCell Culture TechniqueEnzymatic Digestion MethodTissue Slurry FiltrationViability AssessmentClinical Applications

Related Articles