Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama<em> Aedes aegypti</em
Summary
Elektrofizyolojik inceleme ile belirlendiği zaman Aedes aegypti büyük tat uzantıları gen ekspresyonunu değerlendirmek için iki yöntem kullanılarak,, varsayım olarak, acı ve itici bileşikler, nöronal yanıtları altında yatan genlerin dizi belirledik.
Abstract
Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.
Introduction
DEET, Picaridin, sitronellal ve IR3535 gibi bileşikler etkili bir 1,2 aegypti önemli hastalık vektörü Aedes dahil sivrisinek, püskürtmek için gösterilmiştir. Biz sivrisinek iticilik ile ilgili hücreleri belirlemek için özel tat Sensilla ile ilişkili duyusal nöronlar aksiyon potansiyelleri kayıt. Bu dokularda eksprese edilen genlerin alt baş dizilemesi ile birleştiğinde, geliştirilmiş iticilik özellikleri için yeni bileşiklerin taranması için büyük olasılıkla bu hücrelerin yanıtlara aracılık genleri tespit edebilir.
RNA-seq hızla gen ifadesinde zamansal ve mekansal değişiklikleri izleme için standart haline güçlü bir araçtır. RNA seq böcek duyusal kulakçıkların analizleri ve organların büyük gen 6 geleneksel PCR bazlı arama gen iyileştirilmesi, çeşitli insekt türlerinin 3-5 moleküler reseptörlerine ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Böcekler en çeşitli hayvan sınıfını temsil, önbirçok fırsat reyi genler ve benzersiz fenotipleri arasındaki bağlantıyı incelemek için. RNA seq teknoloji herhangi bir yaşayan böcek doku üzerinde kullanılabilecektir. Benzer şekilde, uniporous tat Sensilla duyu hücrelerinden elektrofizyolojik kayıt birçok farklı böcek türleri elde edilebilmektedir. Bu iki teknik eşleştirme araştırmacılar gözlenen kimyasal duyu fenotip dahil set genleri daraltmak için izin verir. Farklı türler belirli zorlukları sunacak, ancak kimyasal duyu reseptör genleri ve bir kimyasal duyu adaptasyon arasındaki bağlantıyı bilgilendirebilir. büyüklüğü ve kimyasal duyu Sensilla morfolojisi değişkendir ve gürültüyü azaltmak ve tekrarlanabilir sinyalleri tespit aksiyon potansiyelleri kaydederken kapsamlı sorun giderme gerekebilir. Kimyasal duyu organlarının diseksiyonu önemsiz ya da hassas ve zaman böcek morfolojisi ve büyüklüğüne bağlı olarak, alıcı olabilir. Yüksek kaliteli RNA Kurtarma böyle sırasında belirli pigmentleri kaçınarak, yanı sıra bazı sorun giderme gerekebilirDoku Kolleksivonu.
Davranış denemelerle itici bileşiklerin etkisini gösteren doğrudan ve bilgilendirici olmakla birlikte, bu yaklaşım, zaman etki mekanizması ile ilgili olarak, yoğun ve geniştir. RNA-seq ile birleştiğinde Elektrofizyoloji böcekler kaçınma davranışları neyin daha spesifik analizler için izin verir. Kimyasal ayrımcılık "araç", bir böcek türlerinde tanımlanmıştır sonra, daha özel girişimler bilinmektedir kovucular mümkündür geliştirmek için. Bu davranışlarından sorumlu duyu hücrelerinde reseptörleri ve ilgili proteinler doğrudan kimyasal tarama için heterolog bir şekilde eksprese edilebilir. Ayrıca, moleküler modelleme kimyasallar bu reseptörlerin 7 güçlü tepkiler hangi tahmin edebilirsiniz.
duyusal dokuların dar kümesindeki tüm aktif genlerin fotoğraf da diğer türlerdeki benzer genlerin tanımlanması yararlı olabilir. Dizi homolojisi ve sentezleme si kullanılarakmilarities, araştırmacılar büyük olasılıkla böcekler üzerinde geniş etkili kovucular yanıtlar aracılık moleküler reseptör setleri oluşturabilir. Biz böcek kimyasal duyu yolları yapısökümünden araştırmacılar yardımcı olmak ve sigara modeli ve ekonomik açıdan önemli böceklerin Nöroetoloji dalmak için fazla ikna için aşağıdaki protokol mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
tat Sensilla gelen kayıt aksiyon potansiyelleri en zorlu yönü hangi yanıtları karar olduğunu "normal." verilen bir böcek türlerinin toplam sayısı ve tat reseptör nöronların hassasiyetleri (GRNs) için ilk defa kayıt tek tat Sensillum ucu istihdam zaman vardır muhtemelen bilinmeyen. Birçok ön kayıtları ilk aralığı ve test etmek için kimyasal konsantrasyonlarını karar gereklidir. Bu durumda, bir tek GRN'de DEET'in (Şekil 1) düşük konsantrasyonlarda yanıt gö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5mL collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
- Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
- Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig, , et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
- Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
- Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
- Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
- Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
- Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
- Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
- Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
- Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).
