एक सह संस्कृति मॉडल शामिल GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स और HEK293 कोशिकाओं में निरोधात्मक synapse गठन stably गाबा जताते_एक रिसेप्टर्स

Summary

व्यक्तिवृत्त दौरान निरोधात्मक GABAergic synapses के गठन के समन्वय कि आणविक तंत्र काफी हद तक अनजान हैं. इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, हम कार्यात्मक GABA _एक रिसेप्टर्स व्यक्त stably ट्रांसफ़ेक्ट मानव भ्रूण गुर्दे 293 (HEK293) कोशिकाओं के साथ साथ सुसंस्कृत भ्रूण मध्यम काँटेदार GABAergic न्यूरॉन्स को शामिल किया गया है, जो एक सह संस्कृति मॉडल प्रणाली विकसित की है.

Abstract

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (γ-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABA_A receptors (GABA_ARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials.

During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABA_ARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other.

To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABA_AR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABA_AR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABA_ARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Introduction

गाबा सबसे प्रचुर मात्रा में उत्तेजक neurotransmitter ग्लूटामेट ¹ पूर्ववर्ती भ्रूण के मस्तिष्क में पाया जल्द से जल्द न्यूरोट्रांसमीटर में से एक है. विकास के दौरान, गाबा excitotoxicity उत्प्रेरण बिना सेल प्रसार, प्रवास और neuronal नेटवर्क के गठन को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, अपरिपक्व न्यूरॉन्स depolarizes और उत्तेजित. वयस्क के मस्तिष्क में, GABA _एक रिसेप्टर चैनलों के लिए उलटा संभावित कारण क्लोराइड के intracellular एकाग्रता में कमी करने के लिए और अधिक नकारात्मक क्षमता में स्थानांतरित किया गया है. इस पारी, समानांतर में, अप-विनियमन सेल के बाहर क्लोराइड transports जो पोटेशियम क्लोराइड सह-ट्रांसपोर्टर (KCC2), के कारण होता है, और नीचे विनियमन है जो सोडियम-पोटेशियम क्लोराइड ट्रांसपोर्टर (NKCC1), की विपरीत प्रभाव ^2.

मस्तिष्क में, गाबा मुख्य रूप से तेज या धीमी गति अन्तर्ग्रथनी निषेध मध्यस्थता GABA _एक या गाबा _बी या तो रिसेप्टर्स करने के लिए, संबंधित बांधly. GABA _एक रुपये भी heteropentameric ionotropic या ligand-gated Cys-पाश आयन चैनल के रूप में जाना जाता रिसेप्टर्स के एक वर्ग के हैं. गाबा के दो अणु, बाइकार्बोनेट आयनों क्लोराइड आयनों के लिए और एक डिग्री कम पारगम्य है जो रिसेप्टर, के क्रियान्वयन के लिए आवश्यक हैं. क्लोराइड प्रवाहकत्त्व में वृद्धि पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन ³ को सक्रिय करने में depolarizing, उत्तेजक घटनाओं की प्रभावशीलता कम हो जाती है.

GABA _एक रुपये की स्ट्रक्चरल विविधता लंबे कार्यात्मक और औषधीय गुणों के अपने विस्तृत श्रृंखला का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में स्वीकार किया गया है. एक आम के साथ α (1-6), β (1-3), γ (1-3), π, ε, δ और θ ^3,: मूल निवासी GABA _एक रुपये के रूप में वर्गीकृत कई isoforms के साथ सब यूनिटों से बना असमलैंगिक pentamers हैं एक बड़ी एन टर्मिनल कोशिकी डोमेन, चार transmembrane डोमेन (टीएमएस), और टीएमएस 3 और 4 ⁴ के बीच एक प्रमुख intracellular डोमेन शामिल ट्रांसमेम्ब्रेन टोपोलॉजी.इन सब यूनिटों की आनुवंशिक विलोपन असर चूहों जन्म ^5,6 के बाद मर जाते हैं क्योंकि β3 और γ2 सब यूनिटों, अन्तर्ग्रथनी निषेध और जीव के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं. इसके विपरीत, α सबयूनिट का व्यक्तिगत isoforms ऐसी चिंता, बेहोश करने की क्रिया, उत्तेजना, और दूसरों के रूप में अलग व्यवहार के साथ जुड़े मस्तिष्क में विशिष्ट synaptic कनेक्शन के समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन व्यक्तिगत रूप से, जीवन ^7-9 के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं. GABA _एक रुपये शक्तिशाली शामक, कृत्रिम निद्रावस्था, anxiolytic और ऐसे बेंज़ोडायज़ेपींस, barbiturates, neurosteroids और एनेस्थेटिक्स ^7,10,11 रूप निरोधी प्रभाव के साथ दवाओं की एक किस्म के लिए कार्रवाई की मुख्य साइटों रहे हैं.

Synaptic GABA _एक रुपये आमतौर पर एक γ2 सबयूनिट, (सबसे अधिक β2 या β3) दो β सब यूनिटों और दो ​​α सब यूनिटों (α1, α2, α3 या α5) ^12,13 होते हैं. अतिरिक्त अन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर्स की प्रबल वर्ग संयोजन में δ सबयूनिट शामिलदो α सब यूनिटों (α4 या α6), और दो ​​β सब यूनिटों (β2 या β3) ¹⁴ के साथ. प्लाज्मा झिल्ली में एक्सोन, डेन्ड्राइट या सोमा, और प्रविष्टि के लिए GABA _एक रुपये की subcellular स्थानीयकरण β-सब यूनिटों ^15,16 की उपस्थिति पर निर्भर हैं. हालांकि, अलग GABA _एक अनुसंधान के चुनिंदा समावेश विशिष्ट α सब यूनिटों (α1, α2, α3 या α5) ^7,17,18 की उपस्थिति के साथ अच्छी तरह से संबद्ध synapses के अलग प्रकार में उपप्रकार. महत्वपूर्ण बात है, चूहों में α1 या α2 सबयूनिट का विलोपन निरोधात्मक synapses के ¹⁹ में ultrastructural परिवर्तन का कारण बनता है. यह GABA _एक synapse गठन को विनियमित करने में एक प्रत्यक्ष भूमिका निभा सकते हैं खुद को रुपये कि पता चलता है.

साक्ष्य GABAergic अन्तर्ग्रथन विकास न्यूरोनल लक्ष्य दोनों अलग निरोधात्मक एक्सोन के प्रकार और कम से समूह है कि रिसेप्टर्स से संपर्क किया जिसमें घटनाओं की एक ठीक समन्वित अनुक्रम, इंगित करता है किनिरोधात्मक अन्तर्ग्रथन के प्रत्येक वर्ग चयनात्मक और ^17,20-22 कार्यात्मक अभ्यस्त हैं. GABAergic synapses पर विशिष्टता के इस मौलिक सिद्धांत पूर्व और postsynaptic भागीदारों synaptic संपर्कों की दीक्षा के दौरान एक दूसरे को पहचान के रूप में कैसे सवाल उठाती है.

इन विट्रो में सह संस्कृति assays के synapse गठन के तंत्र के कुछ अध्ययन करने के लिए और इस प्रक्रिया में व्यक्ति अन्तर्ग्रथनी फांक फैले प्रोटीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है. Synapse गठन और परिपक्वता मध्यस्थता करने के लिए द्वि-directionally समारोह में कहा कि आम पार अन्तर्ग्रथनी बातचीत प्रोटीन संयोजनों में से एक, Neurexins (Nrxns) और Neuroligins (एनएलएस) कर रहे हैं. Nrxns कई अलग अलग isoforms ²³ को जन्म देने के उनके laminin-neurexin-सेक्स हार्मोन बाध्यकारी प्रोटीन डोमेन के भीतर वैकल्पिक splicing है कि प्रदर्शन प्रीसानेप्टिक प्रोटीन, कर रहे हैं. Nrxns भी अन्य प्रोटीनों के साथ बातचीत करते हुए एनएलएस उनके सर्वव्यापक पोस्टअन्तर्ग्रथनी देहात माना जाता है²⁴ rtners. एक साथ इन प्रोटीनों पास और कठोर समानाधिकरण ²⁵ में presynaptic और postsynaptic झिल्ली धारण करने के लिए योगदान करते हैं. दो सबसे प्रचुर मात्रा में isoforms उत्तेजक और निरोधात्मक synapses के क्रमश: ²⁶ में मौजूद हैं जो नाथन -1 और नाथन-2 हैं. ट्रांस-अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए डिज़ाइन जल्द से जल्द सह संस्कृति मॉडल प्रणालियों में से एक, गैर neuronal कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार कार्यरत हैं, इस तरह से अधिक एक्सप्रेस NL- करने के लिए मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293 कोशिकाओं, के रूप में सबसे अधिक अमर सेल लाइनों 2. इन कोशिकाओं pontine न्यूरॉन्स के साथ सुसंस्कृत थे, HEK कोशिकाओं की सतह के पास प्रीसानेप्टिक प्रोटीन का एक संग्रह अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों के गठन का संकेत मनाया गया. इन सह संस्कृतियों को घुलनशील β-neurexin के अलावा Nrxns और एनएलएस के बीच पार अन्तर्ग्रथनी बातचीत अन्तर्ग्रथनी संपर्क गठन ²⁷ के लिए जरूरी हैं, सुझाव है कि संपर्कों के गठन हिचकते. इसके अलावा, क्षणिक अभिव्यक्तिसचिवों की समिति में β-neurexin अलग हिप्पोकैम्पस glutamatergic और GABAergic न्यूरॉन्स पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रोटीन gephryin की और GABA _एक आर सब यूनिटों के प्रेरित अभिव्यक्ति के साथ सह-सुसंस्कृत (सी वी -1 (ओ rigin में) बंदर, और एस V40 आनुवंशिक सामग्री ले जाने) कोशिकाओं की इन दो कोशिकाओं प्रकार ²⁸ के बीच संपर्क के अंक में γ2 और α2. Synapse गठन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक सह संस्कृति मॉडल का एक अन्य उदाहरण क्षणिक GABA _एक अनुसंधान के साथ α2 / β3 / γ2 और नाथन-2, और हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स ²⁹ की एक मिश्रित आबादी सब यूनिटों ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं, शामिल किया गया. इस अध्ययन नाथन -2 की अभिव्यक्ति निरोधात्मक synapses के गठन के लिए एक परम आवश्यकता है कि संपन्न हुआ.

हालांकि, हाल के सह संस्कृति अध्ययन में, stably ट्रांसफ़ेक्ट α1 / β2 / γ2 GABA _एक HEK293 कोशिकाओं में रुपये कार्यात्मक synapses के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त होना पाया गया जब सह-सुसंस्कृत GABAergic मेड के साथअतिरिक्त पार अन्तर्ग्रथनी या पोस्टअन्तर्ग्रथनी आसंजन प्रोटीन की आवश्यकता के बिना IUM काँटेदार न्यूरॉन्स,. नाथन -2 GABA _एक रुपए ³⁰ के साथ सह व्यक्त की गई थी लेकिन, जब synapse गठन और ताकत में एक प्रमुख वृद्धि मनाया गया. यह इस सह संस्कृति मॉडल प्रणाली पहले से वर्णित मॉडल प्रणाली, सबसे जाहिर है एक वृद्धि की संवेदनशीलता और synaptic संपर्क का पता लगाने की विश्वसनीयता पर लाभ है कि इंगित करता है. Synaptic संपर्कों का पता लगाने में समग्र सुधार के लिए योगदान दे दो महत्वपूर्ण कारक हैं: मैं) व्यक्ति की कोशिकाओं की सतह पर GABA _एक आर सब यूनिटों के उच्च और सुसंगत अभिव्यक्ति के साथ stably ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 सेल लाइनों का उपयोग. यह स्थिरता विभिन्न सह-संस्कृति की स्थिति के बीच मात्रात्मक तुलना की सुविधा. द्वितीय) भ्रूण स्ट्रिएटम ³¹ से सुसंस्कृत GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स की एक शुद्ध आबादी का उपयोग allo जटिलताओं और मिश्रित neuronal आबादी और के उपयोग से उत्पन्न अस्पष्टता को हटाथा, उदाहरण के लिए, अन्तर्ग्रथन गठन के दौरान एक दूसरे के साथ तुलना की जा सकती है कि सबसे उपयुक्त पोस्टअन्तर्ग्रथनी GABA _एक आर प्रकार का चयन.

Synapses के गठन के पूर्व और postsynaptic सेल आसंजन परिसरों के भीतर कई पार अन्तर्ग्रथनी संकेतों को शामिल करने के बारे में सोचा है. कारण अन्तर्ग्रथनी संकेतन और सेल आसंजन अणुओं की पर्याप्त संख्या के द्वि-दिशात्मक प्रकृति के कारण, यह अन्तर्ग्रथन गठन में शामिल प्रमुख घटक की पहचान करना मुश्किल है. इस प्रकार, एक गैर neuronal सेल में एक एकल कोशिका आसंजन प्रोटीन transfecting (इस मामले में, विवो में GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स के लिए दो सबसे प्रचलित पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्य, α1 / β2 / γ2 या α1 / β3 / γ2 GABA _एक रुपए ³²⁾ बहुत पोस्टअन्तर्ग्रथनी सतह पर उपलब्ध पार अन्तर्ग्रथनी संकेतों की जटिलता को कम करता है और synapse गठन को बढ़ावा देने में इस प्रोटीन की प्रभावकारिता के सटीक मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है.

Protocol

Sprague-Dawley चूहों या BAB / सी जन्मजात चूहों, ब्रिटेन के गृह कार्यालय [और 24 नवंबर 1986 के यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश के अनुसार रखे और बलिदान किया गया (हरलन, ब्रिटेन इस्तेमाल किया गर्भवती महिलाओं की संख्या 30 थी) (86/609 / ईईसी) ] दिशानिर्देश. परियोजना को औपचारिक रूप से फार्मेसी आचार समिति के UCL स्कूल द्वारा अनुमोदित किया गया था. उपकरण, संस्कृति मध्यम, और व्यंजन के 1. तैयारी चालू करें और हर समय बाँझ परिस्थितियों में काम करने के क्रम में 70% इथेनॉल के साथ लामिना का प्रवाह हुड साफ. (एल glutamine (2 मिमी), पेनिसिलिन (50 इकाइयों / मिलीलीटर), स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), और भ्रूण गोजातीय सीरम Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 7.4 पीएच (DMEM, 500 मिलीलीटर) युक्त, 10 HEK293 सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार करें %). नोट: पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन परेशानी हैं. Neurobasal मध्यम पीएच 7.4 (500 मिलीलीटर), B27 पूरक (25 एमएल), एल glutamine (2 मिमी), पेनिसिलिन युक्त सीरम मुक्त न्यूरोनल संस्कृति के माध्यम से तैयार करें(50 इकाइयों / मिलीलीटर), स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), और ग्लूकोज (6 मिमी). HBSS 10x शेयर (50 मिलीग्राम), HEPES (1 एम) (5 एमएल) और पानी (445 मिलीलीटर), पीएच 7.4 से युक्त HEPES buffered खारा समाधान (HbSS) के 500 मिलीलीटर, तैयार करें. आटोक्लेव फॉस्फेट बफर खारा समाधान (पीबीएस, पीएच 7.4, 1 एल), पानी (1 एल), कांच coverslips (व्यास में 13 मिमी) और उन्हें बाँझ गिलास पाश्चर pipettes. HEK293 स्थिर सेल लाइन के 2. तैयारी α1 / β3 / γ2-GABA एक रुपये जताते एक 10 सेमी बाँझ टिशू कल्चर प्लेट में प्लेट 2×10 6 HEK293 कोशिकाओं और रातोंरात 70-90 confluency% तक पहुंचने के लिए एक humidified 5% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С पर सेते हैं. अगले दिन, G418 disulfate (1 टेबल) प्रतिरोध जीन शामिल pcDN 3.1 (+) अभिव्यक्ति वेक्टर में GABA एक आर α1 सबयूनिट सीडीएनए साथ HEK293 कोशिकाओं transfectऔर phleomycin डी 1 शामिल अभिव्यक्ति वेक्टर में GABA एक आर β3 सबयूनिट सीडीएनए (1 टेबल) प्रतिरोध जीन (दोनों एक मानव cytomegalovirus तत्काल-जल्दी (सीएमवी) प्रमोटर के विनियमन) के तहत नकारात्मक साथ परिसरों जो एक cationic liposome तैयार करने का उपयोग कर, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार आरोप लगाया न्यूक्लिक एसिड अणुओं (तालिका 1). (पीएच 7.4, 1 टेबल) संक्षेप में, कम सीरम माध्यम के 500 μl जोड़ने और 7.5 माइक्रोग्राम प्रति सीडीएनए लिपोसोमल अभिकर्मक बफरिंग अभिकर्मक के 15 μl के बाद बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब, के लिए निर्माण, और धीरे लिए कमरे के तापमान पर रवाना होने से पहले मिश्रण प्रत्येक 5 मिनट. इस मिश्रण को, लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक के 8.75 μl जोड़ने और धीरे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रवाना होने से पहले मिश्रण. इस के बाद, (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) HEK293 सेल संस्कृति के माध्यम से 3 मिलीलीटर जोड़ने, दो बार ऊपर और नीचे transfe अपकेंद्रित्र ट्यूब की सामग्री पिपेटआर बूंद-वार एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान में बढ़ कोशिकाओं पर, और एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С पर 48 घंटे के लिए सेते हैं. निम्नलिखित अनुपात में, बाँझ पीबीएस, पीएच 7.4 के साथ धीरे HEK293 कोशिकाओं को धो लें, और नए 10 सेमी टिशू कल्चर बर्तन में ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं को कमजोर: 1: 3: 1, 5, 1: 7, 1:10, 1:15 और 1:20. यह कोशिकाओं पीढ़ी मिला हुआ नहीं बन जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है. संस्कृति के माध्यम से, प्रत्येक एंटीबायोटिक चयन मार्कर, G418, और Phleomycin डी 1 से 800 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल जोड़कर GABA एक आर सब यूनिटों दोनों व्यक्त HEK293 कोशिकाओं का चयन शुरू करो. एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С में कोशिकाओं को सेते हैं और एंटीबायोटिक युक्त मध्यम (10 एमएल) हर 2 दिन की जगह. छोटे सफेद कालोनियों (आमतौर पर के बारे में 7 दिनों के बाद) फार्म शुरू करते हैं, तो ध्यान से बर्तन में से प्रत्येक से एक भी कॉलोनी का चयन करें और एक बाँझ P1000 उपयोग कर इसे इकट्ठापिपेट टिप. ऊपर और नीचे मध्यम pipetting द्वारा resuspend ध्यान से 500 मध्यम के μl और युक्त एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की एक अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण. ठीक एक कॉलोनी (5-20 कालोनियों की कुल सलाह दी जाती है) अच्छी तरह से प्रत्येक में स्थानांतरित किया है कि सुनिश्चित करें. एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С में कोशिकाओं को सेते हैं और एंटीबायोटिक युक्त मध्यम हर 2 दिन की जगह. कालोनियों 70-80% मिला हुआ बन जाने के बाद, धीरे 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के नीचे से कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए ऊपर और नीचे मध्यम पिपेट. स्थानांतरण और 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में 2 कुओं के बीच कोशिकाओं के निलंबन विभाजित करते हैं. एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С में कोशिकाओं को सेते हैं और एंटीबायोटिक युक्त मध्यम हर 2 दिन की जगह. 70 बार – 80% मिला हुआ है, वही एक कॉलन से होने कोशिकाओं से युक्त 2 कुओं की 1 से कोशिकाओं को इकट्ठाY और तैयार प्रोटीन lysates. संक्षेप में, कोशिकाओं पीबीएस, पीएच 7.4 के साथ 2x धो, और पीबीएस, पीएच 7.4 में 2% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के 200 μl जोड़ें. Lysate लीजिए और microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण. बीसीए प्रोटीन अभिकर्मक का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता उपाय निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार (1 टेबल देखें). इन के बारे में जानकारी के लिए 1 टेबल देखें, एसडीएस / पृष्ठ द्वारा GABA एक रिसेप्टर्स की α1 और β3 सब यूनिटों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें और (खरगोश विरोधी α1 विशेष और खरगोश विरोधी β3-विशिष्ट GABA एक आर एंटीबॉडी सबयूनिट विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoblotting एंटीबॉडी). बेदखल और बड़े 6 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन के लिए शेष कुओं से ही सकारात्मक क्लोन हस्तांतरण. एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С में कोशिकाओं को सेते हैं और एंटीबायोटिक युक्त मध्यम हर 2 दिन की जगह. धीरे धीरे कोशिकाओं यू की कालोनियों का विस्तार10 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन और अंत में टिशू कल्चर बोतल (टी 75 बोतल) के लिए उन्हें स्थानांतरित करने से एंटीबायोटिक चयन nder. एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С में कोशिकाओं को सेते हैं और एंटीबायोटिक युक्त मध्यम हर 2 दिन की जगह. कांच coverslips पर प्रत्येक कॉलोनी से 70,000 कोशिकाओं (व्यास में 13 मिमी) प्लेट और immunofluorescence द्वारा GABA एक आर सब यूनिटों की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति और सह स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं को ठीक. (एक 10 सेमी बाँझ टिशू कल्चर डिश में GABA एक रिसेप्टर्स, थाली 2 x 10 6 कोशिकाओं के दोनों α1 और β3 सब यूनिटों के उच्च स्तर व्यक्त HEK293 कोशिकाओं की सकारात्मक क्लोन का चयन करें और एक humidified 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री С पर सेते सीओ 2 इनक्यूबेटर) रात भर. कोशिकाओं हर समय एंटीबायोटिक युक्त (G418 और Phleomycin डी 1) मध्यम में incubated हैं कि सुनिश्चित करें. अगले दिन, HEK transfectGABA एक अनुसंधान के साथ 293 कोशिकाओं pcDNA ™ 3.1 (+) एक गैर लिपोसोमल लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक (1 टेबल) का उपयोग hygromycin बी प्रतिरोध जीन शामिल अभिव्यक्ति वेक्टर में सबयूनिट सीडीएनए γ2s. नोट: इस अभिकर्मक विधि बेहतर अस्तित्व और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ निरंतर चयन तहत कर रहे हैं जो धीमी गति से बढ़ रही है स्थिर सेल लाइनों में विदेशी प्रोटीन की उच्च अभिव्यक्ति दक्षता की अनुमति देता है. एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में, 250 बढ़ाने की μl और डीएनए संक्षेपण बफर (1 टेबल) और γ2s गाबा का 1.4 माइक्रोग्राम प्रति एक रिसेप्टर सबयूनिट सीडीएनए जोड़ें. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रवाना होने से पहले 1 सेकंड के लिए 11.2 बढ़ाने के μl और भंवर जोड़ें. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रवाना होने से पहले 10 सेकंड के लिए गैर लिपोसोमल लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक और भंवर के 35 μl जोड़ें. G418 / Phleomycin डी 1-युक्त मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें और दो बार BEF ऊपर और नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब की सामग्री पिपेटअयस्क एक 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट में बढ़ कोशिकाओं पर ड्रॉप के लिहाज से यह स्थानांतरित. एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С पर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. निम्नलिखित अनुपात में, बाँझ पीबीएस के साथ धीरे कोशिकाओं को धो लें और नए 10 सेमी टिशू कल्चर बर्तन में उन्हें पतला: 3, 1: 1 से 5, 1: 7, 01:10, 01:15 और 01:20. Γ2s सबयूनिट व्यक्त / β3-HEK293 कोशिकाओं / Phleomycin मध्यम डी 1-युक्त G418 के लिए एंटीबायोटिक चयन मार्कर hygromycin बी के 800 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल जोड़कर α1 का चयन शुरू करो. ताजा G418 / Phleomycin डी 1 / hygromycin बी युक्त मध्यम (10 एमएल) हर 2 दिन के साथ पुराने मध्यम बदलें. दोहराएँ G418 में निरंतर चयन के तहत, 2.7-2.12 कदम / Phleomycin डी 1 / hygromycin सेल संस्कृति के माध्यम बी युक्त. एंटीबायोटिक मुक्त सेल संस्कृति माध्यम और भविष्य में उपयोग के लिए 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में -140 डिग्री सेल्सियस पर सकारात्मक क्लोन स्टोर. स्तर का परीक्षणअभिव्यक्ति के कारण एंटीबायोटिक चयन के तहत कोशिकाओं का कम अस्तित्व के लिए बदल सकते हैं क्योंकि और α1, β3 की अभिव्यक्ति की, defrosting निम्नलिखित प्रत्येक क्लोन में immunoblotting और immunofluorescence द्वारा GABA एक आर सब यूनिटों γ2s. HEK293 सेल लाइनों के 3. रखरखाव एक 15 मिलीलीटर बाँझ में सेल संस्कृति के माध्यम से 10 एमएल में (ऊपर वर्णित) नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं की एक शीशी या उन व्यक्त α1 या तो / β2 / γ2-GABA एक रुपये (1 टेबल) या α1 / β3 / γ2-GABA एक रुपये Defrost अपकेंद्रित्र ट्यूब. 5 मिनट के लिए 440 XG पर अपकेंद्रित्र अतिरिक्त DMSO के हटाने के लिए. ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें. प्रथम पाली डी lysine (0.1 मिलीग्राम / एमएल) और resuspended कोशिकाओं की तो 1 मिलीलीटर के साथ लेपित एक 10 सेमी टिशू कल्चर डिश के लिए ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से 9 मिलीलीटर जोड़ें. , पक्ष की ओर, धीरे आंदोलन कोशिकाओं को फैलाने के लिए और एक humidified में 37 डिग्री С पर सेते5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर). अगले दिन, किसी भी सेल मलबे को हटाने और नए सिरे से HEK293 सेल संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर के साथ बदलने के लिए मध्यम महाप्राण. GABA एक आर सब यूनिटों व्यक्त करते हैं और इसलिए भी एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों की अभिव्यक्ति की कमी नहीं है जो किसी भी कोशिकाओं को हटाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ स्थिर सेल लाइनों का चयन करें. Α1 / β2 / γ2 स्थिर सेल लाइन के लिए, G418 (800 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) युक्त ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से सामान्य मध्यम जगह. Α1 / β3 / γ2 सेल लाइन के लिए, ताजा सेल संस्कृति के माध्यम G418 (800 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) को रोकने के साथ की जगह, Phleomycin डी 1 (800 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और hygromycin बी (800 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल). चेतावनी! G418 एक अड़चन है और hygromycin बी, संक्षारक विषाक्त और एक अड़चन है. पारित होने के एक कम घनत्व में बोने से एक नए ऊतक संस्कृति डिश में कोशिकाओं वे> 70% confluency प्राप्त एक बार. महाप्राण 10 सेल संस्कृति के माध्यम से मिली और दो बार संक्षिप्त साथ धोनेपीबीएस, पीएच 7.4. 1 ट्रिप्सिन-EDTA समाधान, प्रोटीज trypsin के एक समाधान (0.05% trypsin) और पीबीएस में एक सीए 2 + chelator EDTA (0.02%), 7.4 पीएच, पकवान से कोशिकाओं को अलग करने के मिलीलीटर. चेतावनी! ट्रिप्सिन-EDTA जोड़ें समाधान एक अड़चन है. पकवान, सही एंटीबायोटिक दवाओं युक्त सेल संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं महाप्राण. 5 मिनट के लिए 440 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सेल संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर में उन्हें resuspend. पैसेज ताजा सेल संस्कृति माध्यम और सही एंटीबायोटिक दवाओं युक्त एक नए टिशू कल्चर कुप्पी (टी 75 फ्लास्क) में एक 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग कोशिकाओं. एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С में कोशिकाओं को सेते हैं और मध्यम हर दो दिन की जगह. पारित होने कोशिकाओं जब> 70% मिला हुआ (2.8 कदम देखें). GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन संस्कृति की 4. तैयारी बाँझ परिस्थितियों में एक 24-हम तैयारपाली एल Lysine (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ करूँगा थाली coverslips लिपटे (व्यास में 13 मिमी) और एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С पर सेते हैं. अगले दिन, महाप्राण एक विंदुक के साथ अतिरिक्त पाली एल लाइसिन और दो संक्षिप्त 10 सेकंड और बाँझ पानी के साथ दो 5 मिनट लंबा washes के साथ coverslips धो लो. रातोंरात laminin (0.01 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें और एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С पर सेते हैं. 70% इथेनॉल के साथ विच्छेदन क्षेत्र को साफ करता है और इस तरह घुमावदार और सीधे ऊतक संदंश, कैंची और चिमटी के रूप में विदारक उपकरणों की एक सरणी इकट्ठा, और पूरी तरह विदारक उपकरणों बाँझ 70% इथेनॉल में जगह है. अपनी पीठ पर सीओ 2 के साथ euthanized गर्भवती चूहे / माउस प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ अपने पेट पर त्वचा को साफ. आंतरिक अंगों और गर्भाशय प्रकट करने के लिए, चिमटी के साथ त्वचा चुटकी और त्वचा, मांसपेशियों और पेरिटोनियम के माध्यम से पेट के आसपास कटौतीस्पष्ट रूप से भ्रूण के साथ. गर्भाशय से भ्रूण (E16-17) निकालें और ठंडा पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश में उन्हें जगह है. लामिना का प्रवाह हुड में भ्रूण रखें और ठंडा HBSS के साथ एक नया पेट्री डिश में सिर इकट्ठा करने, उन्हें सिर काटना. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, घुमावदार और सीधे संदंश का उपयोग दिमाग काटना. ठंडा HBSS युक्त एक नया पेट्री डिश में दिमाग रखें. दो मस्तिष्क गोलार्द्धों अलग और ध्यान से तानिका हटा दें. हिप्पोकैम्पस की रेखा के साथ कट और स्ट्रिएटम प्रकट करने के लिए कोर्टेक्स वापस छील. गोलार्द्ध के पूर्वकाल में एक धारीदार सफेद संरचना के रूप में स्ट्रिएटम का निरीक्षण करें. स्ट्रिएटम काटना और बहुत छोटे टुकड़ों में काट (1 – व्यास में 2 मिमी) और 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सामग्री एकत्र करने के लिए एक आग पॉलिश पाश्चर पिपेट का उपयोग करें. आग चमकाने सामग्री क्षतिग्रस्त किया जा रहा बिना एकत्र किया जाता है सुनिश्चित करता है. आग पॉलिश तिवारी का उपयोगपाश्चर पिपेट की पी, कोशिकाओं महाप्राण और उन्हें 8 रिलीज – 10 बार. यह सजातीय प्रकट होने तक 6 बार – अपने मूल व्यास (1 मिमी) का लगभग 30% की एक आग पॉलिश टिप के साथ एक नया पिपेट ले रहा है, समाधान एक और 4 triturate. एक ताजा बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 100 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी का उपयोग कोशिकाओं फ़िल्टर. एक hemocytometer साथ कोशिकाओं की गणना और एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में अच्छी तरह से प्रति न्यूरोनल संस्कृति के माध्यम से 500 μl में 70,000 कोशिकाओं थाली. कुओं का अधिकार है और इन विट्रो (DIV) में 14 दिनों के लिए एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С पर सेते के लिए छोड़ दिया आंदोलन. 7 दिनों के बाद, neuronal संस्कृतियों की शुद्धता की जांच और, glia कोशिकाओं मौजूद हैं, साइटोसिन β-डी-arabinoside जोड़ने (आरा-सी, 5 माइक्रोन) वेल्स को उनके प्रसार को रोकने के लिए. ऐसा करने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से न्यूरोनल संस्कृति के माध्यम से (7.4 पीएच) के 250 μl हटाने और ताजा माध्यम के 250 μl होते जोड़नाआईएनजी आरा-सी. चेतावनी! आरा-सी एक अड़चन है. 5. सह संस्कृति तैयारी न्यूरोनल संस्कृति के दिन 11, कोट बाँझ शर्तों के तहत पाली डी lysine (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली और एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С पर रातोंरात सेते हैं. अगले दिन (न्यूरोनल संस्कृति के दिन 12), अतिरिक्त पाली डी lysine aspirate और एक छोटी राशि के साथ कोट करने के लिए (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) कुओं ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से जोड़ने से पहले बाँझ पानी के साथ 5 मिनट के लिए कुओं 2x संक्षिप्त और 2x धोने मध्यम से सीरम की. टिशू कल्चर कुप्पी (टी 75) से संस्कृति के माध्यम aspirate. सीए 2 + 1 मिलीलीटर जोड़ने से पहले दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं कुल्ला / 2 मिलीग्राम + -chelating एजेंट EDTA धीरे और गैर enzymatically कोशिकाओं विखंडित जो (0.48 मिमी). ऊतक कुप्पी के नीचे से उन्हें अलग करने के लिए कोशिकाओं आंदोलन. (सेल संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर जोड़ेंइस रूप में एंटीबायोटिक दवाओं) अभिकर्मक के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, बिना एक बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं और जगह महाप्राण. एक कम गति पीठ टॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग कर 5 मिनट के लिए 440 XG पर गोली कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला निकालें और ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend. एक hemocytometer का उपयोग, 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 3 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं और थाली गिनती. धीरे आंदोलन और एक humidified 5% सीओ 2 के वातावरण (सीओ 2 इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री С पर 24 घंटे के लिए सेते हैं. अगले दिन (न्यूरोनल संस्कृति के दिन 13) क्षणिक लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग pcDNA3 अभिव्यक्ति निर्माण में mCherry सीडीएनए साथ HEK293 कोशिकाओं transfect. संक्षेप में, एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में, कम सीरम माध्यम के 500 μl और mCherry सीडीएनए के 5 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें. लिपोसोमल बफरिंग अभिकर्मक के 5 μl जोड़ें और धीरे 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रवाना होने से पहले मिश्रण. लिपोसोमल अभिकर्मक reag की 8.75 μl जोड़ेंईएनटी और धीरे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रवाना होने से पहले मिश्रण. (सीओ 2 इनक्यूबेटर) स्थानांतरण बूंद-वार अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट पर प्रत्येक के लिए और एक humidified 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री С पर सेते हैं, दो बार ऊपर और नीचे microcentrifuge ट्यूब की सामग्री पिपेट. अगले दिन (न्यूरोनल संस्कृति के दिन 14), 6 कुओं में से प्रत्येक से HEK293 सेल संस्कृति के माध्यम aspirate और पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ एक अच्छी तरह से दो बार संक्षिप्त धो लो. सीए 2 + की 300 μl जोड़ें / 2 मिलीग्राम + -chelating एजेंट EDTA (0.48 मिमी) और trypsin-EDTA के 200 μl (0.02-0.48 मिमी) अच्छी तरह से प्रत्येक का हल और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री С पर सेते हैं. एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलग कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से ताजा HEK293 सेल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें (इस ट्रिप्सिन quenches) और महाप्राण. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 440 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें. न्यूरोनल संस्कृति के माध्यम से (7.4 पीएच) के 500 μl में गोली Resuspend. </ ली> एक hemocytometer का उपयोग, न्यूरॉन्स युक्त एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में अच्छी तरह से प्रति 30,000 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं और बीज गिनती. 24 घंटे के लिए (सीओ 2 इनक्यूबेटर) कोशिकाओं को फैलाने और एक humidified 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री С पर सह संस्कृतियों सेते थाली आंदोलन. Synaptic संपर्कों और उनकी गतिविधियों के 6. विश्लेषण सह संस्कृति में 23 घंटे के बाद, GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स और HEK293 कोशिकाओं एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ संयुग्मित विरोधी synaptotagmin luminal डोमेन विशिष्ट एंटीबॉडी की गतिविधि पर निर्भर तेज उपयोग कर के बीच 'सक्रिय' संपर्कों के गठन की जांच (Cy5, 1 टेबल देखें) . नोट: एंटीबॉडी केवल synaptotagmin की luminal डोमेन, के लिए पहुँच प्राप्त करेंगे के लिए अन्तर्ग्रथनी पुटिका लुमेन और बाह्य अंतरिक्ष के बीच निरंतरता है जब यह बांध जो. यह विशेष रूप से इस antib बनाने, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के दौरान होता हैसक्रिय presynaptic टर्मिनलों के एक उत्कृष्ट मार्कर ODY. और neuronal मध्यम में 01:50 पतला Cy5 लेबल माउस विरोधी synaptotagmin एंटीबॉडी, (Neurobasal एक मध्यम, 7.4 पीएच) जोड़ने के लिए, करने के लिए, सबसे पहले न्यूरोनल माध्यम के साथ सह संस्कृतियों (देखें तालिका 1 एक मध्यम, पीएच 7.4 Neurobasal) कुल्ला संस्कृतियों, 30 मिनट के लिए. एक humidified 5% सीओ 2 माहौल में 37 डिग्री С में इस समय (सीओ 2 इनक्यूबेटर) के दौरान कोशिकाओं को सेते हैं. सह संस्कृतियों धोने, एंटीबॉडी के उपयोग को दूर करने के लिए संक्षेप में तीन बार: प्रथम, द्वितीय ठंड पीबीएस (7.4 पीएच) 200 मिमी NaCl युक्त, और ठंड सामान्य पीबीएस के साथ तीसरे के साथ ठंड सामान्य पीबीएस (7.4 पीएच), के साथ (7.4 पीएच) आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde / 4% sucrose के 300 μl (पीएफए, 7.4 पीएच) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें. दो अब 10 मिनट washes के साथ फिर पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ संक्षिप्त कोशिकाओं को दो बार धोएं. पीएफए ​​बुझाने के आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ग्लाइसिन (0.3 एम) जोड़ें. कोशिकाओं को धो brieflY दो बार तो पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ दो अब 10 मिनट washes के साथ की गैर विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए समाधान (/ वी) गोजातीय सीरम albumin पीबीएस में (बीएसए), पीएच 7.4 डब्ल्यू 1% () अवरुद्ध की 300 μl जोड़ने से पहले एंटीबॉडी. अवरुद्ध समाधान Aspirate और गिनी पिग γ2 एन टर्मिनल डोमेन 33 के खिलाफ निर्देशित विरोधी GABA एक आर-γ2 एंटीबॉडी जोड़ें: रातोंरात 4 डिग्री С पर (1 पीबीएस में 3000, 7.4 पीएच). अगले दिन, कुओं से प्राथमिक एंटीबॉडी महाप्राण और दो अब 10 मिनट washes के साथ फिर पीबीएस के साथ संक्षिप्त कोशिकाओं को दो बार धो लो. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान में ट्राइटन X-100 (0.1%) का उपयोग कोशिकाओं permeabilize. माउस विरोधी glutamic एसिड decarboxylase या तो जोड़ने से पहले दो अब 10 मिनट washes के साथ फिर पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ संक्षिप्त कोशिकाओं को दो बार धोएं (जीएडी) 65 एंटीबॉडी (1: 4000, 1 टेबल) या माउस विरोधी synapsin मैं एंटीबॉडी ( 1: 1,000, कमरा टी में 120 मिनट के लिए 1 टेबल)emperature. दो अब 10 मिनट washes के साथ फिर पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ संक्षिप्त कोशिकाओं को दो बार धो लें और फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान जोड़ें. अपकेंद्रित्र में एंटीबॉडी के समुच्चय को दूर करने के लिए (आमतौर पर 2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर एलेक्सा Fluor 488 या बकरी विरोधी माउस आईजीजी एलेक्सा Fluor 405, सभी को संयुग्मित विरोधी गिनी Cy5 संयुग्मित सुअर आईजीजी, बकरी विरोधी माउस आईजीजी बकरी) उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान के लिए: 21910 10 मिनट के लिए XG, और एंटीबॉडी (750 1) जोड़ें. 1 घंटे के लिए कुओं उपयुक्त और प्रकाश जोखिम और फलस्वरूप photobleaching से fluorophores की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करने के लिए लागू करें. अंत में, किसी भी अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी हटाने और बढ़ते अभिकर्मक (लम्बा गोल्ड, 1 टेबल) coverslip प्रति लगभग 10 μl का उपयोग coverslips के माउंट करने के लिए दो अब 10 मिनट washes के साथ फिर पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ संक्षिप्त कोशिकाओं को दो बार धो लो. 4 को स्थानांतरित करने से पहले प्रकाश से सुरक्षित है, जबकि कमरे के तापमान पर सेट करने के लिए 24 घंटे की अनुमति देंलंबी अवधि के भंडारण के लिए С °. एक 63X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग नमूनों का विश्लेषण करें. प्रकाश के स्तर को सुनिश्चित करने और डिटेक्टर लाभ संतृप्ति से बचने के लिए निकाला जाता है. मैं या Cy5 लेबल विरोधी synaptotagmin synapsin GAD65 के लिए सकारात्मक प्रीसानेप्टिक टर्मिनल, और डीआईसी द्वारा या mCherry फ्लोरोसेंट indictor द्वारा कल्पना पोस्टअन्तर्ग्रथनी HEK293 कोशिकाओं के बीच सह-स्थानीयकरण के क्षेत्रों के रूप में संभावित अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों को ध्यान से देखें. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग सेल प्रति 5 माइक्रोन – 4 की गहराई के माध्यम से – ऑप्टिकल वर्गों (10 8) के z ढेर श्रृंखला का उपयोग संभावित अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों गणना.

Representative Results

इस न्यूरॉन HEK293 सेल सह संस्कृति मॉडल प्रणाली के लिए प्रोटोकॉल सूक्ष्मता इष्टतम सेल अस्तित्व की अनुमति से परिचित हो चुका है. इस प्रणाली में, अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों के गठन और उनके विश्लेषण एक कार्यात्मक रिसेप्टर में इकट्ठा सभी तीन GABA एक आर सब यूनिटों के स्थिर और लगातार अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है. यह neuronal संस्कृतियों को जोड़ने से पहले HEK293 सेल की सतह पर सबयूनिट अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण करने के लिए immunocytochemical विश्लेषण का उपयोग करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है. इन प्रयोगों में, α1, β2 और γ2 सब यूनिटों (चित्रा 1 ए), या α1, β3 और γ2 सब यूनिटों (चित्रा 1 बी) की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति, इन सब यूनिटों के बाह्य epitopes करने के लिए बाध्य है, जो सबयूनिट विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग पाया गया. HEK293 सतह पर इन सब यूनिटों के बीच सह-स्थानीयकरण के एक उच्च स्तर का प्रदर्शन किया गया था. GABA एक की सतह अभिव्यक्ति और सह स्थानीयकरण पुष्टि करने के बादHEK293 कोशिकाओं, सह संस्कृतियों में आर सब यूनिटों α1 / β2 / γ2 GABA एक आर सब यूनिटों और 14 दिनों (इन विट्रो में 14 दिनों (DIV)) के लिए सुसंस्कृत मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स व्यक्त HEK293 कोशिकाओं का उपयोग कर तैयार कर रहे थे. सह-संस्कृति में कोशिकाओं तय, 24 घंटे के लिए incubated और immunocytochemistry और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग विश्लेषण किया गया. संपर्कों का विश्लेषण GAD65 पॉजिटिव GABAergic अक्षतंतु टर्मिनलों नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं (चित्रा 2A, 2 बी) के साथ ही छिटपुट संपर्कों का गठन संकेत दिया कि. 4 घंटे में पता चला संपर्कों की संख्या HEK293 सेल प्रति 7.3 ± 0.9 था, और इस संख्या सभ्य न्यूरॉन्स को HEK293 कोशिकाओं को जोड़ने के बाद 24 घंटे में HEK293 सेल प्रति 5.5 ± 0.5 कनेक्शन (± SEM के मतलब है) के लिए कम हो गया था. इसके विपरीत, GAD65 पॉजिटिव GABAergic अक्षतंतु टर्मिनलों GABA एक रुपये व्यक्त HEK293 कोशिकाओं के साथ कई अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों का गठन. HEK293 कोशिकाओं को जोड़ने के बाद 4 घंटे में प्राप्त संपर्कों की संख्या HEK293 सेल प्रति 28.3 ± 4.7 था, और इस संख्या में और वृद्धि था52.1 ± 6.3 डी सह संस्कृति में 24 घंटा (चित्रा 2A, 2 बी) में HEK293 सेल प्रति (± SEM के मतलब है). इन अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों थे कि क्या यह निर्धारित करने के लिए 'सक्रिय' यानी vesicular ट्रांसमीटर रिहाई समर्थित, एक पुटिका-luminal डोमेन-विशिष्ट विरोधी synaptotagmin Cy5 संयुग्मित एंटीबॉडी ऊष्मायन के 23 घंटे के बाद सह-संस्कृति के माध्यम से जोड़ा गया है. इस एंटीबॉडी केवल प्रीसानेप्टिक तंत्रिका टर्मिनलों में शामिल किया है जब अन्तर्ग्रथनी पुटिका लुमेन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के दौरान अन्तर्ग्रथनी फांक में कोशिकी द्रव के बीच एक ताकना रूपों. रिहाई के बाद, ताकना Cy5 संयुग्मित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी पुटिका अंदर synaptotagmin से जुड़ी synaptotagmin छोड़ने, बंद कर देता है. इस तरह, सक्रिय रूप से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज में लगे हुए ही पुटिकाओं एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं. कुछ इन प्रयोगों में किसी भी नियंत्रण के बीच संपर्कों HEK293 कोशिकाओं और मध्यम काँटेदार न्यूरॉन टर्मिनलों थे 'सक्रिय & #8217; HEK293 कोशिकाओं में प्रीसानेप्टिक GAD65 / synaptotagmin प्रतिदीप्ति और mCherry प्रतिदीप्ति (चित्रा 3 ए) के बीच सह स्थानीयकरण की कमी से दिखाया गया है. इसके विपरीत, कई 'सक्रिय' संपर्क मध्यम काँटेदार न्यूरॉन टर्मिनलों और α1 / β2 / γ2 व्यक्त GAD65 / synaptotagmin और mCherry के बीच सह-स्थानीयकरण के एक उच्च स्तर से पता चला HEK293 कोशिकाओं, विशेष रूप से HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त (बीच का गठन किया गया 3B चित्रा). मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स के साथ HEK293 कोशिकाओं व्यक्त GABA एक अनुसंधान के विभिन्न उप-प्रकार भी इन विट्रो में अन्तर्ग्रथन-तरह के गठन को प्रोत्साहित कर सकते हैं कि क्या परीक्षण करने के लिए, हम सह सुसंस्कृत α1 / β3 / γ2. फिर, नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं शायद ही कभी तक पहुँचने synapsin पॉजिटिव presynaptic टर्मिनलों के साथ संपर्क प्राप्त ± 0.48 10.8 सह संस्कृति (चित्रा -4 ए छोड़ दिया, 4 बी) में 24 घंटा के बाद HEK293 सेल प्रति संपर्क (± SEM के मतलब है). हालांकि, HEK293 कोशिकाओं व्यक्तsynapsin पॉजिटिव प्रीसानेप्टिक सह संस्कृति में 24 घंटे के बाद HEK293 सेल प्रति 25.3 ± 0.27 (± SEM के मतलब) संपर्क पहुँचने के मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स के टर्मिनलों (चित्रा -4 ए अधिकार के साथ अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों α1 / β3 / γ2 GABA एक रुपये फार्म काफी अधिक, 4 बी). अपनी शक्ति α1 / β2 / γ2 युक्त GABA एक रुपये की शक्ति की तुलना में कम है, हालांकि यह α1 / β3 / γ2 GABA एक रुपये HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त इंगित करता है कि, भी अन्तर्ग्रथनी संपर्क गठन को बढ़ावा देने में सक्षम हैं. इन प्रयोगों हमारी प्रयोगशाला में विकसित सह संस्कृति मॉडल प्रणाली इस प्रक्रिया में GABA एक रुपये की अलग उपप्रकार की प्रभावकारिता के मात्रात्मक विट्रो में synaptic संपर्क गठन के विश्लेषण के साथ ही मूल्यांकन परमिट कि संकेत मिलता है. इन प्रयोगों के आगे, GABAergic synapses के महत्वपूर्ण कार्यात्मक घटक होने के अलावा कि GABA एक रुपये का प्रदर्शन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैंमान्यता और स्वतंत्र रूप से अन्य अन्तर्ग्रथनी आसंजन प्रोटीन की निरोधात्मक न्यूरॉन्स और उपयुक्त न्यूरोनल लक्ष्य कोशिकाओं के बीच synaptic संपर्कों के गठन की प्रक्रिया में. चित्रा 1. Immunocytochemical GABA एक आर α1 की अभिव्यक्ति के विश्लेषण / β2 / γ2 या स्थिर HEK293 सेल लाइनों में α1 / β3 / γ2. GABA एक आर सब यूनिटों के बाह्य डोमेन पहचानने एंटीबॉडी कोशिका की सतह पर व्यक्त लेबल रिसेप्टर्स करने के लिए इस्तेमाल किया गया. ( ए) HEK293 सेल लाइन व्यक्त α1 (एलेक्सा Fluor 488), β2 (एलेक्सा Fluor 555) और उच्च स्तर पर γ2 (Cy5). (बी) HEK293 सेल लाइन व्यक्त α1 (एलेक्सा Fluor 488), β2 (एलेक्सा Fluor 555) और γ2 (Cy5)उच्च स्तरों पर सब यूनिटों. स्केल बार:. 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. चित्रा 2. GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स सह संस्कृति में HEK293 कोशिकाओं व्यक्त α1 / β2 / γ2- साथ अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों के रूप में. (ए) (सही नीले रंग में,) फ्लोरोसेंट विरोधी GAD65 एंटीबॉडी के साथ presynaptic टर्मिनलों की लेबलिंग (हरे रंग में) और या GABA एक आर γ2 सबयूनिट (लाल, बाएँ में) mCherry साथ HEK293 कोशिकाओं, इन दोनों के बीच सह-स्थानीयकरण के अंक से पता चला सह संस्कृति में 4 या 24 घंटे के बाद अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों के गठन का संकेत मार्करों. स्केल बार:. 10 माइक्रोन (बी) अन्तर्ग्रथन की तरह सह के मात्रात्मक विश्लेषण ntacts. एक के प्रत्येक ऑप्टिकल अनुभाग में आंखों से गिना गया डीआईसी इमेजिंग और / या mCherry अभिव्यक्ति, और जीएडी-65 सकारात्मक puncta (हरे रंग में) और HEK293 कोशिकाओं की सतह के बीच संपर्कों की संख्या से पता चला HEK293 कोशिकाओं उनके आकार के आधार पर पहचान की गई z ढेर श्रृंखला (8 – 10) इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग सेल प्रति, और संपर्कों / सेल की संख्या के रूप में व्यक्त किया. ग्राफ सह संस्कृति में 4 और 24 घंटे के बाद मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स और नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं (हल्का भूरा) या α1 / β2 / γ2-HEK293 कोशिकाओं (काला) के बीच संपर्कों की संख्या से पता चलता है (± SEM के मतलब, एन = प्रत्येक में 8 दो स्वतंत्र प्रयोगों से हालत). यह आंकड़ा फुच्स एट अल से संशोधित किया गया है. (2013) 30. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. विज्ञापन / 52115 / 52115fig3highres.jpg "चौड़ाई =" 600 "/> चित्रा 3. GABA एक रुपये अन्तर्ग्रथन तरह GAD65 के लिए सकारात्मक मध्यम काँटेदार न्यूरॉन टर्मिनलों के बीच सह-संस्कृति में 24 घंटे के बाद गठित संपर्क (एलेक्सा Fluor 405 सियान) और (ए) नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं की. Immunolabeling सक्रिय synaptic संपर्कों के गठन को बढ़ावा देने, या (बी) HEK293-α1 / β2 / γ2 कोशिकाओं, क्षणिक mCherry साथ ट्रांसफ़ेक्ट दोनों (लाल) का निर्माण. सक्रिय संपर्कों प्रीसानेप्टिक टर्मिनल में दोनों पुटिका luminal डोमेन-विशिष्ट विरोधी synaptotagmin एंटीबॉडी (Cy5) और GAD65 विशिष्ट एंटीबॉडी के बीच सह स्थानीयकरण द्वारा पहचाने जाते हैं, और mCherry HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त किया. स्केल बार:. 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. igure 4 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 6in "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg "चौड़ाई =" 600 "/> चित्रा 4. GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स सह संस्कृति में HEK293 कोशिकाओं व्यक्त α1 / β3 / γ2- सबयूनिट साथ अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों के रूप में. (ए) विरोधी synapsin (बाएं) मैं एंटीबॉडी (हरे रंग में), और नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं, या α1 साथ presynaptic टर्मिनलों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग / β3 / γ2 HEK293 कोशिकाओं को व्यक्त करने, दोनों क्षणिक (लाल रंग में) mCherry साथ ट्रांसफ़ेक्ट, के अंक से पता चला सह संस्कृति में 24 घंटे के बाद अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों के गठन का संकेत इन मार्करों के बीच सह स्थानीयकरण. स्केल बार: 10 माइक्रोन (बी). अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों के मात्रात्मक विश्लेषण. HEK293 कोशिकाओं mCherry अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की गई है, और synapsin मैं पॉजिटिव puncta (हरे रंग में) और HEK293 कोशिकाओं की सतह के बीच संपर्कों की संख्या एक z ढेर श्रृंखला के प्रत्येक ऑप्टिकल अनुभाग में आंखों से गिना गया (8-10) इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग सेल प्रति, और संपर्कों / सेल की संख्या के रूप में व्यक्त किया. ग्राफ मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स और नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं (हल्का भूरा) या α1 / β3 / γ2-HEK293 कोशिकाओं (काला) के सह-संस्कृति में 24 घंटे के बाद दोनों के बीच संपर्कों की संख्या से पता चलता है (± SEM के मतलब, एन = 8-12 कोशिकाओं में दो स्वतंत्र प्रयोगों से हर हालत,). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन नहीं है, सबसे सटीक और repeatable सह संस्कृति assays के लक्ष्य को हासिल करने के लिए पीछा किया जाना चाहिए कि कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. सबसे पहले, सुसंस्कृत मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स एक इष्टतम घनत्व पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए. बहुत कम वरीयता प्राप्त है, न्यूरॉन्स बहुत धीरे धीरे विकसित करते हैं और जीवित रहने की बहुत कम है. बहुत घनी वरीयता प्राप्त अगर दूसरी ओर, न्यूरॉन्स HEK293 कोशिकाओं के साथ संपर्क का विश्लेषण समझौता जो कुल के लिए करते हैं. दूसरे, यह क्षणिक स्थिरतापूर्वक पूर्व सह संस्कृति में उन्हें platting के लिए, GABA _एक रुपये व्यक्त HEK293 कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट संवाददाता, GFP या mCherry व्यक्त करने के लिए सिफारिश की है. यह इन कोशिकाओं और neuronal संस्कृतियों में दुर्लभ जीवित glia सेल के बीच आकार और आकार में समानता से समझौता किया जा सकता है जो HEK293 कोशिकाओं, के विश्वसनीय मान्यता देता है. GFP या mCherry सीडीएनए साथ कुशल अभिकर्मक प्राप्त करने, HEK293 सेल लाइनों घातीय विकास के चरण में होना है और6 अच्छी तरह प्लेटों में उपयुक्त घनत्व पर वरीयता प्राप्त. अभिकर्मक द्वारा पीछा विरल बोने से अधिक-बोने सीडीएनए ऊपर लेने से कोशिकाओं को रोकने जाएगा जबकि कोशिकाओं, खराब बढ़ने के लिए प्रेरित करेगा. अभिकर्मक के दिन पर 90% मिला हुआ है – वे 70 के बीच हैं इतना है कि आदर्श रूप में, कोशिकाओं वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए. कुछ सेल लाइनों दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं के रूप में तीसरा, अभिकर्मक, प्रयोग प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. विधान गाबा HEK293 कोशिकाओं में _ए आर अभिव्यक्ति सेल अस्तित्व और अभिकर्मक के बाद ठीक करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता कम कर देता है क्योंकि यह है. इसके अलावा, अस्तित्व के कुछ सेल लाइनों काफी दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील होने के साथ, HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त GABA _एक रुपये के प्रकार पर निर्भर करता है. लिपोसोमल अभिकर्मक का उपयोग अभिकर्मक, तेजी से बढ़ सेल लाइनों में विदेशी प्रोटीन व्यक्त उच्च अभिकर्मक दक्षता और अभिव्यक्ति के स्तर दोनों प्रदान करने के लिए एक इष्टतम तरीका है. हालांकि, इस अभिकर्मक के लिए, धीरे-धीरे बढ़ रहा है सेल लाइनों के लिए बहुत ज्यादा नुकसान का कारण बनता हैजो हम नियमित रूप से एक गैर लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करें. इस लिपोसोमल अभिकर्मक के लिए एक समान तरीके से काम करता है, लेकिन कुशल अभिकर्मक के लिए आवश्यक डीएनए की मात्रा काफी कम है. यह अधिक से अधिक सेल अस्तित्व की अनुमति देता है (लगभग 80 – 90% से 60% का उपयोग लिपोसोमल अभिकर्मक के साथ तुलना में), लेकिन कम अभिकर्मक दक्षता (60%) के साथ. अन्त में, नियंत्रण HEK293 या α1 की संख्या / β2 / γ2 HEK293 neuronal संस्कृतियों में जोड़ा कोशिकाओं व्यक्त अनुकूलित किया जाना चाहिए. वे बहुत दुर्लभ हो जाते हैं क्योंकि बहुत कुछ कोशिकाओं को जोड़ने, HEK293 कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच संपर्कों के सफल विश्लेषण समझौता. इसके विपरीत, बहुत सारे HEK293 कोशिकाओं को जोड़ने के कुछ ही घंटों के भीतर neuronal सेल मौत का कारण बनता है.

भ्रूण मध्यम काँटेदार न्यूरॉन संस्कृतियों आदर्श भ्रूण उम्र 15 से विच्छेदित striatal ऊतक का उपयोग कर तैयार किया जाना चाहिए – हालांकि 17., यह अक्सर भ्रूण इष्टतम उम्र की तुलना में थोड़ा छोटा या पुराने हैं कि क्या होता है. इस मामले में, न्यूरॉन्स की संख्या संस्कृति में वरीयता प्राप्त होगाअलग किया जा करने की जरूरत है. E15 की तुलना में छोटी है कि ऊतक E17 इष्टतम सेल अस्तित्व अनुमति देने के लिए, एक उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त होना पड़ सकता से अधिक पुराना है कि ऊतक, जबकि एक से थोड़ा कम घनत्व पर वरीयता प्राप्त होना पड़ सकता है. इसके अलावा, साइटोसिन arabinoside (आरा-सी) पुराने ऊतक में अधिक प्रचुर मात्रा में है जो glia के विकास को रोकने के लिए पुराने संस्कृतियों को जोड़े जाने की जरूरत हो सकती है.

सह संस्कृतियों बनाते समय उपरोक्त के रूप में, यह, ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 या α1 / β2 / γ2 HEK293 व्यक्त कोशिकाओं के अनुकूलित नंबर प्लेट के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, यह क्योंकि उनके अस्तित्व में मतभेद की, प्रत्येक व्यक्ति सेल लाइन के लिए यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इस वातानुकूलित न्यूरोनल मध्यम बहुत अधिक पतला नहीं है कि यह सुनिश्चित करता है और के रूप में आमतौर पर 50 μl की अधिकतम मात्रा में 30,000 कोशिकाओं, पहले से ही न्यूरोनल संस्कृति के माध्यम से 500 μl जिसमें एक 24 अच्छी तरह से पकवान, के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा जाना चाहिए शर्तों कि प्रत्येक के भीतर अच्छी तरह से, जैसे काफी स्थिर रहना </em> वृद्धि कारकों की एकाग्रता. अच्छी तरह संस्करणों प्रत्येक के लिए अधिक से अधिक से अधिक 50 μl जोड़ने से आम तौर पर न्यूरॉन्स मार डालेंगे.

सह संस्कृति तकनीक के प्रमुख नुकसान में से एक neuronal संस्कृतियों न्यूरॉन्स अपने सामान्य microenvironment से हटा दिया है और उनके सामान्य संरचनात्मक संगठन स्थापित करने में असमर्थ रहे हैं किया गया है जिसका मतलब है कि एक monolayer, के रूप में हो अलग कोशिकाओं से बनाया जाता है. इसलिए वे अन्तर्ग्रथन विकास के प्रारंभिक चरणों प्रभावित कर सकते हैं कि अन्य कोशिकाओं से उचित कनेक्शन, जानकारी और स्रावित अणुओं की कमी है. उदाहरण के लिए, इन विवो मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स घनी इन आदानों striatal ऊतक के विच्छेदन के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं क्योंकि glutamatergic synapses के फार्म नहीं है हमारे neuronal संस्कृतियों में, हालांकि, कॉर्टेक्स, थैलेमस और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों ^{में 34} से glutamatergic आदानों द्वारा innervated रहे हैं. कैसे सुसंस्कृत मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स में कार्यात्मक glutamatergic synapses के अभाव AFFECTS GABA _एक रुपये व्यक्त एक दूसरे को और / या HEK293 कोशिकाओं के साथ GABAergic synapses के फार्म करने की क्षमता एक खुला प्रश्न बना हुआ है. इस सवाल आसानी से कॉर्टिकल glutamatergic न्यूरॉन्स जिससे उन्हें ³⁵ पूर्व HEK293 कोशिकाओं के अलावा के लिए कार्यात्मक synapses के फार्म के लिए अनुमति के साथ साथ मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स संवर्धन द्वारा संबोधित किया जा सकता है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण परिपक्वता और synapse गठन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है जो cytoarchitecture के कुछ बनाए रखने जो organotypic टुकड़ा संस्कृतियों पर आधारित एक सह संस्कृति मॉडल प्रणाली डिजाइन करने के लिए किया जाएगा. हालांकि, organotypic टुकड़ा संस्कृतियों यहाँ प्रदर्शन विश्लेषण समझौता कर सकते हैं, जो घने और विषम neuropil है. यह एक उच्च पर्याप्त सतह अभिव्यक्ति ³⁰ दी synapse गठन के लिए आवश्यक होने के लिए नहीं दिखाई देता है हालांकि सह संस्कृति assays के उपयोग का एक और महत्वपूर्ण नुकसान, GABA _एक रुपये वे न्यूरॉन्स में हैं क्लस्टर नहीं कर रहे हैं HEK293 कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की है. उदाहरण के लिए, आर मेंodent मस्तिष्क और हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों में, α1 GABA _एक आर सबयूनिट पिरामिड कोशिकाओं के सभी पोस्टअन्तर्ग्रथनी डोमेन पर सबसे GABAergic synapses में पाया जाता है. हालांकि, α2 विशेष रूप से somata पर synapses और dendrites की एक सबसेट में स्थित है लेकिन इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ³⁶ से पता चला अत्यधिक, अक्षतंतु प्रारंभिक खंड में समृद्ध है. सह संस्कृतियों में synapse गठन अभी भी मज़बूती से पता लगाया जा सकता है कि यह देखते हुए और ³⁰ का विश्लेषण किया, इस HEK293 कोशिकाओं की कोशिका की सतह पर GABA _एक रुपये का घनत्व अन्तर्ग्रथनी भीतर इन रिसेप्टर्स के घनत्व की तुलना करने के लिए भी इसी तरह, या और भी अधिक हो सकता है न्यूरॉन्स में समूहों. यह कम से कम इस तरह gephyrin जैसे neuroligin रूप अन्तर्ग्रथनी आसंजन प्रोटीन, और पोस्टअन्तर्ग्रथनी घनत्व प्रोटीन, उचित इकट्ठे GABA _एक रुपये पर्याप्त में मौजूद हैं, तो सह संस्कृतियों में synapse गठन के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं क्यों भाग में, व्याख्या कर सकते हैं घनत्व.

यह अच्छी तरह से GABA _एक रुपये संरचनात्मक रूप और कार्यात्मक विषम हैं कि दस्तावेज है, और रिसेप्टर सबयूनिट रचना उनके subcellular स्थानीयकरण और औषधीय गुणों को निर्धारित करता है. सबयूनिट लगभग विशेष रूप से उपस्थित extrasynaptic GABA _एक रुपये में है जबकि उदाहरण के लिए, 2 सब यूनिटों का समावेश GABA _एक रुपये की synaptic स्थानीयकरण के लिए एक शर्त होने के लिए जाना जाता है. केवल संयोजनों αβ शामिल है कि रिसेप्टर्स भी मुख्य रूप से extrasynaptic डोमेन ^{12- 14} के लिए स्थानीय माना जाता है. इस विशिष्टता हमारे सह संस्कृति प्रणाली में बनाए रखा है चाहे आसानी से क्षणिक neuronal संस्कृतियों को जोड़ने से पहले, स्थिरतापूर्वक α और β सब यूनिटों व्यक्त HEK293 सेल लाइनों में 2 या सबयूनिट cDNAs transfecting द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का उपयोग हमारी प्रारंभिक प्रयोगों synaptic संपर्कों आसानी तकनीक और नवीनता का संकेत है कि केवल 2 सबयूनिट की उपस्थिति में गठन कर रहे हैं कि सुझाव दिया हैvivo में मनाया ficity विट्रो में संरक्षित किए जाने की संभावना है (नहीं दिखाया डेटा).

इसके अलावा, विभिन्न α सब यूनिटों को शामिल GABA _एक रुपये चुनिंदा प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार के साथ बनाई synaptic संपर्कों के लिए स्थानीय कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, ग्लोबस पैलिडस में, α1-GABA _एक रुपये आम तौर पर striatopallidal (STR-जीपी) और क्रमशः, dendrites और मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स की दैहिक क्षेत्रों पर स्थित हैं जो palliopallidal (जीपी जीपी) अन्तर्ग्रथन, पर पाए जाते हैं. α3-GABA _एक रुपये मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स की perisomatic क्षेत्रों में स्थित हैं और इन न्यूरॉन्स के बाहर का डेन्ड्राइट पर स्थित है और स्ट्रिएटम ³² से आदानों द्वारा मुख्य रूप से संपर्क कर रहे हैं α2-GABA _एक रुपये, जबकि स्थानीय जीपी अक्षतंतु कोलेटरल से संपर्क कर रहे हैं. Synapses के और अलग न्यूरोनल डिब्बों में विभिन्न प्रकार में विशिष्ट α सब यूनिटों की अभिव्यक्ति भी ऐसे HIPP के रूप में अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रदर्शन किया गया हैocampus ²¹ और ^18,20 नियोकॉर्टेक्स. इन निष्कर्षों विशिष्ट निरोधात्मक synapses के मस्तिष्क में गठन कर रहे हैं के रूप में कैसे सवाल उठा. प्रीसानेप्टिक टर्मिनल के एक विशिष्ट प्रकार के आसंजन संपर्क के अंक में विशिष्ट GABA _एक आर उपप्रकार की प्रविष्टि के लिए प्रेरित करता है? रिसेप्टर्स उनकी प्लाज्मा झिल्ली प्रविष्टि विशिष्ट मूल के axonal टर्मिनलों के आसंजन के लिए एक शर्त है जहां उनकी सबयूनिट संरचना, के अनुसार विशिष्ट subcellular स्थानों के लिए तस्करी कर रहे हैं? तिथि करने के लिए, इन सवालों के जवाब अनुत्तरित रह. इस तरह के सह संस्कृति मॉडल प्रणाली के रूप में कम मॉडल प्रणाली का उपयोग करते हैं, प्रणाली महत्वपूर्ण बात, डीएनए निर्माणों और अभिकर्मकों के आवेदन की अभिकर्मक को आसानी से उत्तरदायी है और क्योंकि हमें इस जटिल सवालों का जवाब शुरू करने के लिए अनुमति देते हैं, यह जीना सेल इमेजिंग विश्लेषण के लिए उपयुक्त है ^30. इस प्रकार, इस मॉडल प्रणाली का उपयोग कर हम जानते हैं, GABA _एक रुपये के विभिन्न प्रकार सहित व्यक्तिगत अणुओं की भूमिका का परीक्षण शुरू कर सकते हैंएन synaptic संपर्कों में उपस्थित होने के लिए. एक और लाभ यह मिनट के भीतर घंटे के लिए तेजी से इस मॉडल प्रणाली के रूप में synapses, प्रयोगों की अवधि को कम करता है. इसी तरह के सह संस्कृति मॉडल प्रणाली सफलतापूर्वक उपन्यास synaptogenic अणुओं ^27,37,38 के लिए स्क्रीन करने के लिए अतीत में कार्यरत थे.

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकसित करता है समझ कैसे, परिपक्व और उदाहरण, व्यवहार या अनुभूति के लिए नियंत्रण करने के लिए इतना जटिल न्यूरॉन्स के बीच रूपों कनेक्शन, मौलिक महत्व का है. यह दूर उद्देश्य केवल विकास के दौरान मान्यता और सेल करने वाली सेल संचार के अलग-अलग चरणों है कि सरकार आणविक तंत्र की रूपरेखा द्वारा प्राप्त किया जाएगा. कारण सरासर जटिलता, इन कई सेलुलर बातचीत के आणविक विवरण वर्तमान में केवल कम सिस्टम में परिशुद्धता के साथ अध्ययन किया जा सकता है. हालांकि, क्षमता प्रोटीन के कई संयोजनों को व्यक्त करने और कैसे अध्ययन करके इन प्रणालियों की जटिलता को बढ़ाने के लिएवे उदाहरण के लिए, आनुवंशिक विलोपन दृष्टिकोण, के साथ तुलना में कुछ फायदे हैं बातचीत. एक जीन विलोपन के प्रभाव की सटीक व्याख्या अक्सर विशेष रूप से विकासशील मस्तिष्क में, मूल घावों के प्रभाव मास्किंग प्रतिपूरक तंत्र के साथ जुड़े परिवर्तन से समझौता किया है क्योंकि यह है. यहाँ वर्णित सरल अभी तक जानकारीपूर्ण सह संस्कृति तकनीक synapse गठन में GABA _एक रुपये की संरचनात्मक भूमिका की खोज की अनुमति दी और GABA _एक रुपये और अन्य सेल आसंजन अणुओं और / या अन्तर्ग्रथनी मैट्रिक्स प्रोटीन एक दूसरे के साथ बातचीत कैसे की जांच के लिए एक संभावना खोल दिया है synaptogenesis दौरान. Synaptic मैट्रिक्स प्रोटीन वे हाल ही में glutamatergic synapse गठन ³⁹ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन किया गया है कि दिए गए विशेष रुचि के हैं. वे 'सामान्य और गाइड जो आणविक तंत्र की हमारे ज्ञान अग्रिम करने की क्षमता है क्योंकि सह संस्कृति मॉडल के आगे विकास के लिए महत्वपूर्ण है# 8217; मस्तिष्क के विकास और इस प्रकार इन तंत्र ऐसे मिर्गी, पागलपन, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार और कई अन्य लोगों के रूप में कई neurodevelopmental रोगों में बदल रहे हैं की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए.

Materials

Name	Company/Individual	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Serum)	Life Technologies	11960-044	Warm in water bath at 37 ° С before use
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Danger: irritant
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	10106-169
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	Warm in water bath at 37 ° С before use
B27 Supplement	Life Technologies	17504-044
Glucose	Sigma-Aldrich	G8769
HBSS (10X)	Life Technologies	14180-046
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-056
PBS (1X)	Life Technologies	10010-031
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)	Life Technologies	V790-20
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)	Life Technologies	V860-20
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)	Life Technologies	V870-20
Stable HEKα1β2γ2 line	Sanofi-Synthelabo, Paris
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P1149
G418 disulfate salt (Geneticin)	Sigma-Aldrich	G5013	Danger: irritant
Phleomycin D1 (Zeocin)	Life Technologies	R25001
Hygromycin B	Life Technologies	10687-010	Danger: toxic, irritant and corrosive
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	Warm in water bath at 37 ° С before use Danger: Irritant.
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P6282
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
100 μm Nylon Cell Strainer	VWR	734-0004
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich	C1768	Danger: Irritant
Chelating agent (Versene)	Life Technologies	15040-033
liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).	Life Technologies	15338-100	Alternative transfection method: Effectene Reagent
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)	Qiagen	301425
Reduced serum medium (Opti-MEM)	Life Technologies	11058-021
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5	Synaptic Systems	105311C5
Neurobasal A	Life Technologies	10888-022
Sodium Chloride (NaCl)	VWR	27810.364
Glycine	Sigma-Aldrich	G1726
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3294
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody	Prof. Jean Marc Fritschy	N/A
	(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.
	J. Comp. Neurol. 359 (1) 154–194 (1995).
Triton X-100	Promega	H5141
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody	Merck Millipore	MAB351
Mouse anti-synapsin antibody	Synaptic Systems	106-011
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17)	Merck Millipore	MAB341
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody	Professor Anne Stephenson	N/A
	(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody	Merck Millipore	AP1085
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody	Merck Millipore	AP124S
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody	Life Technologies	A31553
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody	Life Technologies	A21422
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	Life Technologies	A11008
Mounting reagent (Prolong Gold)	Life Technologies	P36930	Use at room temperature