व्यक्तिवृत्त दौरान निरोधात्मक GABAergic synapses के गठन के समन्वय कि आणविक तंत्र काफी हद तक अनजान हैं. इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, हम कार्यात्मक GABA एक रिसेप्टर्स व्यक्त stably ट्रांसफ़ेक्ट मानव भ्रूण गुर्दे 293 (HEK293) कोशिकाओं के साथ साथ सुसंस्कृत भ्रूण मध्यम काँटेदार GABAergic न्यूरॉन्स को शामिल किया गया है, जो एक सह संस्कृति मॉडल प्रणाली विकसित की है.
Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (γ-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials.
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other.
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.
गाबा सबसे प्रचुर मात्रा में उत्तेजक neurotransmitter ग्लूटामेट 1 पूर्ववर्ती भ्रूण के मस्तिष्क में पाया जल्द से जल्द न्यूरोट्रांसमीटर में से एक है. विकास के दौरान, गाबा excitotoxicity उत्प्रेरण बिना सेल प्रसार, प्रवास और neuronal नेटवर्क के गठन को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, अपरिपक्व न्यूरॉन्स depolarizes और उत्तेजित. वयस्क के मस्तिष्क में, GABA एक रिसेप्टर चैनलों के लिए उलटा संभावित कारण क्लोराइड के intracellular एकाग्रता में कमी करने के लिए और अधिक नकारात्मक क्षमता में स्थानांतरित किया गया है. इस पारी, समानांतर में, अप-विनियमन सेल के बाहर क्लोराइड transports जो पोटेशियम क्लोराइड सह-ट्रांसपोर्टर (KCC2), के कारण होता है, और नीचे विनियमन है जो सोडियम-पोटेशियम क्लोराइड ट्रांसपोर्टर (NKCC1), की विपरीत प्रभाव 2.
मस्तिष्क में, गाबा मुख्य रूप से तेज या धीमी गति अन्तर्ग्रथनी निषेध मध्यस्थता GABA एक या गाबा बी या तो रिसेप्टर्स करने के लिए, संबंधित बांधly. GABA एक रुपये भी heteropentameric ionotropic या ligand-gated Cys-पाश आयन चैनल के रूप में जाना जाता रिसेप्टर्स के एक वर्ग के हैं. गाबा के दो अणु, बाइकार्बोनेट आयनों क्लोराइड आयनों के लिए और एक डिग्री कम पारगम्य है जो रिसेप्टर, के क्रियान्वयन के लिए आवश्यक हैं. क्लोराइड प्रवाहकत्त्व में वृद्धि पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन 3 को सक्रिय करने में depolarizing, उत्तेजक घटनाओं की प्रभावशीलता कम हो जाती है.
GABA एक रुपये की स्ट्रक्चरल विविधता लंबे कार्यात्मक और औषधीय गुणों के अपने विस्तृत श्रृंखला का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में स्वीकार किया गया है. एक आम के साथ α (1-6), β (1-3), γ (1-3), π, ε, δ और θ 3,: मूल निवासी GABA एक रुपये के रूप में वर्गीकृत कई isoforms के साथ सब यूनिटों से बना असमलैंगिक pentamers हैं एक बड़ी एन टर्मिनल कोशिकी डोमेन, चार transmembrane डोमेन (टीएमएस), और टीएमएस 3 और 4 4 के बीच एक प्रमुख intracellular डोमेन शामिल ट्रांसमेम्ब्रेन टोपोलॉजी.इन सब यूनिटों की आनुवंशिक विलोपन असर चूहों जन्म 5,6 के बाद मर जाते हैं क्योंकि β3 और γ2 सब यूनिटों, अन्तर्ग्रथनी निषेध और जीव के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं. इसके विपरीत, α सबयूनिट का व्यक्तिगत isoforms ऐसी चिंता, बेहोश करने की क्रिया, उत्तेजना, और दूसरों के रूप में अलग व्यवहार के साथ जुड़े मस्तिष्क में विशिष्ट synaptic कनेक्शन के समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन व्यक्तिगत रूप से, जीवन 7-9 के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं. GABA एक रुपये शक्तिशाली शामक, कृत्रिम निद्रावस्था, anxiolytic और ऐसे बेंज़ोडायज़ेपींस, barbiturates, neurosteroids और एनेस्थेटिक्स 7,10,11 रूप निरोधी प्रभाव के साथ दवाओं की एक किस्म के लिए कार्रवाई की मुख्य साइटों रहे हैं.
Synaptic GABA एक रुपये आमतौर पर एक γ2 सबयूनिट, (सबसे अधिक β2 या β3) दो β सब यूनिटों और दो α सब यूनिटों (α1, α2, α3 या α5) 12,13 होते हैं. अतिरिक्त अन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर्स की प्रबल वर्ग संयोजन में δ सबयूनिट शामिलदो α सब यूनिटों (α4 या α6), और दो β सब यूनिटों (β2 या β3) 14 के साथ. प्लाज्मा झिल्ली में एक्सोन, डेन्ड्राइट या सोमा, और प्रविष्टि के लिए GABA एक रुपये की subcellular स्थानीयकरण β-सब यूनिटों 15,16 की उपस्थिति पर निर्भर हैं. हालांकि, अलग GABA एक अनुसंधान के चुनिंदा समावेश विशिष्ट α सब यूनिटों (α1, α2, α3 या α5) 7,17,18 की उपस्थिति के साथ अच्छी तरह से संबद्ध synapses के अलग प्रकार में उपप्रकार. महत्वपूर्ण बात है, चूहों में α1 या α2 सबयूनिट का विलोपन निरोधात्मक synapses के 19 में ultrastructural परिवर्तन का कारण बनता है. यह GABA एक synapse गठन को विनियमित करने में एक प्रत्यक्ष भूमिका निभा सकते हैं खुद को रुपये कि पता चलता है.
साक्ष्य GABAergic अन्तर्ग्रथन विकास न्यूरोनल लक्ष्य दोनों अलग निरोधात्मक एक्सोन के प्रकार और कम से समूह है कि रिसेप्टर्स से संपर्क किया जिसमें घटनाओं की एक ठीक समन्वित अनुक्रम, इंगित करता है किनिरोधात्मक अन्तर्ग्रथन के प्रत्येक वर्ग चयनात्मक और 17,20-22 कार्यात्मक अभ्यस्त हैं. GABAergic synapses पर विशिष्टता के इस मौलिक सिद्धांत पूर्व और postsynaptic भागीदारों synaptic संपर्कों की दीक्षा के दौरान एक दूसरे को पहचान के रूप में कैसे सवाल उठाती है.
इन विट्रो में सह संस्कृति assays के synapse गठन के तंत्र के कुछ अध्ययन करने के लिए और इस प्रक्रिया में व्यक्ति अन्तर्ग्रथनी फांक फैले प्रोटीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है. Synapse गठन और परिपक्वता मध्यस्थता करने के लिए द्वि-directionally समारोह में कहा कि आम पार अन्तर्ग्रथनी बातचीत प्रोटीन संयोजनों में से एक, Neurexins (Nrxns) और Neuroligins (एनएलएस) कर रहे हैं. Nrxns कई अलग अलग isoforms 23 को जन्म देने के उनके laminin-neurexin-सेक्स हार्मोन बाध्यकारी प्रोटीन डोमेन के भीतर वैकल्पिक splicing है कि प्रदर्शन प्रीसानेप्टिक प्रोटीन, कर रहे हैं. Nrxns भी अन्य प्रोटीनों के साथ बातचीत करते हुए एनएलएस उनके सर्वव्यापक पोस्टअन्तर्ग्रथनी देहात माना जाता है24 rtners. एक साथ इन प्रोटीनों पास और कठोर समानाधिकरण 25 में presynaptic और postsynaptic झिल्ली धारण करने के लिए योगदान करते हैं. दो सबसे प्रचुर मात्रा में isoforms उत्तेजक और निरोधात्मक synapses के क्रमश: 26 में मौजूद हैं जो नाथन -1 और नाथन-2 हैं. ट्रांस-अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए डिज़ाइन जल्द से जल्द सह संस्कृति मॉडल प्रणालियों में से एक, गैर neuronal कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार कार्यरत हैं, इस तरह से अधिक एक्सप्रेस NL- करने के लिए मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293 कोशिकाओं, के रूप में सबसे अधिक अमर सेल लाइनों 2. इन कोशिकाओं pontine न्यूरॉन्स के साथ सुसंस्कृत थे, HEK कोशिकाओं की सतह के पास प्रीसानेप्टिक प्रोटीन का एक संग्रह अन्तर्ग्रथन की तरह संपर्कों के गठन का संकेत मनाया गया. इन सह संस्कृतियों को घुलनशील β-neurexin के अलावा Nrxns और एनएलएस के बीच पार अन्तर्ग्रथनी बातचीत अन्तर्ग्रथनी संपर्क गठन 27 के लिए जरूरी हैं, सुझाव है कि संपर्कों के गठन हिचकते. इसके अलावा, क्षणिक अभिव्यक्तिसचिवों की समिति में β-neurexin अलग हिप्पोकैम्पस glutamatergic और GABAergic न्यूरॉन्स पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रोटीन gephryin की और GABA एक आर सब यूनिटों के प्रेरित अभिव्यक्ति के साथ सह-सुसंस्कृत (सी वी -1 (ओ rigin में) बंदर, और एस V40 आनुवंशिक सामग्री ले जाने) कोशिकाओं की इन दो कोशिकाओं प्रकार 28 के बीच संपर्क के अंक में γ2 और α2. Synapse गठन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक सह संस्कृति मॉडल का एक अन्य उदाहरण क्षणिक GABA एक अनुसंधान के साथ α2 / β3 / γ2 और नाथन-2, और हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स 29 की एक मिश्रित आबादी सब यूनिटों ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं, शामिल किया गया. इस अध्ययन नाथन -2 की अभिव्यक्ति निरोधात्मक synapses के गठन के लिए एक परम आवश्यकता है कि संपन्न हुआ.
हालांकि, हाल के सह संस्कृति अध्ययन में, stably ट्रांसफ़ेक्ट α1 / β2 / γ2 GABA एक HEK293 कोशिकाओं में रुपये कार्यात्मक synapses के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त होना पाया गया जब सह-सुसंस्कृत GABAergic मेड के साथअतिरिक्त पार अन्तर्ग्रथनी या पोस्टअन्तर्ग्रथनी आसंजन प्रोटीन की आवश्यकता के बिना IUM काँटेदार न्यूरॉन्स,. नाथन -2 GABA एक रुपए 30 के साथ सह व्यक्त की गई थी लेकिन, जब synapse गठन और ताकत में एक प्रमुख वृद्धि मनाया गया. यह इस सह संस्कृति मॉडल प्रणाली पहले से वर्णित मॉडल प्रणाली, सबसे जाहिर है एक वृद्धि की संवेदनशीलता और synaptic संपर्क का पता लगाने की विश्वसनीयता पर लाभ है कि इंगित करता है. Synaptic संपर्कों का पता लगाने में समग्र सुधार के लिए योगदान दे दो महत्वपूर्ण कारक हैं: मैं) व्यक्ति की कोशिकाओं की सतह पर GABA एक आर सब यूनिटों के उच्च और सुसंगत अभिव्यक्ति के साथ stably ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 सेल लाइनों का उपयोग. यह स्थिरता विभिन्न सह-संस्कृति की स्थिति के बीच मात्रात्मक तुलना की सुविधा. द्वितीय) भ्रूण स्ट्रिएटम 31 से सुसंस्कृत GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स की एक शुद्ध आबादी का उपयोग allo जटिलताओं और मिश्रित neuronal आबादी और के उपयोग से उत्पन्न अस्पष्टता को हटाथा, उदाहरण के लिए, अन्तर्ग्रथन गठन के दौरान एक दूसरे के साथ तुलना की जा सकती है कि सबसे उपयुक्त पोस्टअन्तर्ग्रथनी GABA एक आर प्रकार का चयन.
Synapses के गठन के पूर्व और postsynaptic सेल आसंजन परिसरों के भीतर कई पार अन्तर्ग्रथनी संकेतों को शामिल करने के बारे में सोचा है. कारण अन्तर्ग्रथनी संकेतन और सेल आसंजन अणुओं की पर्याप्त संख्या के द्वि-दिशात्मक प्रकृति के कारण, यह अन्तर्ग्रथन गठन में शामिल प्रमुख घटक की पहचान करना मुश्किल है. इस प्रकार, एक गैर neuronal सेल में एक एकल कोशिका आसंजन प्रोटीन transfecting (इस मामले में, विवो में GABAergic मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स के लिए दो सबसे प्रचलित पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्य, α1 / β2 / γ2 या α1 / β3 / γ2 GABA एक रुपए 32) बहुत पोस्टअन्तर्ग्रथनी सतह पर उपलब्ध पार अन्तर्ग्रथनी संकेतों की जटिलता को कम करता है और synapse गठन को बढ़ावा देने में इस प्रोटीन की प्रभावकारिता के सटीक मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है.
इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन नहीं है, सबसे सटीक और repeatable सह संस्कृति assays के लक्ष्य को हासिल करने के लिए पीछा किया जाना चाहिए कि कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. सबसे पहले, सुसंस्कृत मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स एक इष्टतम घनत्व पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए. बहुत कम वरीयता प्राप्त है, न्यूरॉन्स बहुत धीरे धीरे विकसित करते हैं और जीवित रहने की बहुत कम है. बहुत घनी वरीयता प्राप्त अगर दूसरी ओर, न्यूरॉन्स HEK293 कोशिकाओं के साथ संपर्क का विश्लेषण समझौता जो कुल के लिए करते हैं. दूसरे, यह क्षणिक स्थिरतापूर्वक पूर्व सह संस्कृति में उन्हें platting के लिए, GABA एक रुपये व्यक्त HEK293 कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट संवाददाता, GFP या mCherry व्यक्त करने के लिए सिफारिश की है. यह इन कोशिकाओं और neuronal संस्कृतियों में दुर्लभ जीवित glia सेल के बीच आकार और आकार में समानता से समझौता किया जा सकता है जो HEK293 कोशिकाओं, के विश्वसनीय मान्यता देता है. GFP या mCherry सीडीएनए साथ कुशल अभिकर्मक प्राप्त करने, HEK293 सेल लाइनों घातीय विकास के चरण में होना है और6 अच्छी तरह प्लेटों में उपयुक्त घनत्व पर वरीयता प्राप्त. अभिकर्मक द्वारा पीछा विरल बोने से अधिक-बोने सीडीएनए ऊपर लेने से कोशिकाओं को रोकने जाएगा जबकि कोशिकाओं, खराब बढ़ने के लिए प्रेरित करेगा. अभिकर्मक के दिन पर 90% मिला हुआ है – वे 70 के बीच हैं इतना है कि आदर्श रूप में, कोशिकाओं वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए. कुछ सेल लाइनों दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं के रूप में तीसरा, अभिकर्मक, प्रयोग प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. विधान गाबा HEK293 कोशिकाओं में ए आर अभिव्यक्ति सेल अस्तित्व और अभिकर्मक के बाद ठीक करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता कम कर देता है क्योंकि यह है. इसके अलावा, अस्तित्व के कुछ सेल लाइनों काफी दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील होने के साथ, HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त GABA एक रुपये के प्रकार पर निर्भर करता है. लिपोसोमल अभिकर्मक का उपयोग अभिकर्मक, तेजी से बढ़ सेल लाइनों में विदेशी प्रोटीन व्यक्त उच्च अभिकर्मक दक्षता और अभिव्यक्ति के स्तर दोनों प्रदान करने के लिए एक इष्टतम तरीका है. हालांकि, इस अभिकर्मक के लिए, धीरे-धीरे बढ़ रहा है सेल लाइनों के लिए बहुत ज्यादा नुकसान का कारण बनता हैजो हम नियमित रूप से एक गैर लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करें. इस लिपोसोमल अभिकर्मक के लिए एक समान तरीके से काम करता है, लेकिन कुशल अभिकर्मक के लिए आवश्यक डीएनए की मात्रा काफी कम है. यह अधिक से अधिक सेल अस्तित्व की अनुमति देता है (लगभग 80 – 90% से 60% का उपयोग लिपोसोमल अभिकर्मक के साथ तुलना में), लेकिन कम अभिकर्मक दक्षता (60%) के साथ. अन्त में, नियंत्रण HEK293 या α1 की संख्या / β2 / γ2 HEK293 neuronal संस्कृतियों में जोड़ा कोशिकाओं व्यक्त अनुकूलित किया जाना चाहिए. वे बहुत दुर्लभ हो जाते हैं क्योंकि बहुत कुछ कोशिकाओं को जोड़ने, HEK293 कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच संपर्कों के सफल विश्लेषण समझौता. इसके विपरीत, बहुत सारे HEK293 कोशिकाओं को जोड़ने के कुछ ही घंटों के भीतर neuronal सेल मौत का कारण बनता है.
भ्रूण मध्यम काँटेदार न्यूरॉन संस्कृतियों आदर्श भ्रूण उम्र 15 से विच्छेदित striatal ऊतक का उपयोग कर तैयार किया जाना चाहिए – हालांकि 17., यह अक्सर भ्रूण इष्टतम उम्र की तुलना में थोड़ा छोटा या पुराने हैं कि क्या होता है. इस मामले में, न्यूरॉन्स की संख्या संस्कृति में वरीयता प्राप्त होगाअलग किया जा करने की जरूरत है. E15 की तुलना में छोटी है कि ऊतक E17 इष्टतम सेल अस्तित्व अनुमति देने के लिए, एक उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त होना पड़ सकता से अधिक पुराना है कि ऊतक, जबकि एक से थोड़ा कम घनत्व पर वरीयता प्राप्त होना पड़ सकता है. इसके अलावा, साइटोसिन arabinoside (आरा-सी) पुराने ऊतक में अधिक प्रचुर मात्रा में है जो glia के विकास को रोकने के लिए पुराने संस्कृतियों को जोड़े जाने की जरूरत हो सकती है.
सह संस्कृतियों बनाते समय उपरोक्त के रूप में, यह, ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 या α1 / β2 / γ2 HEK293 व्यक्त कोशिकाओं के अनुकूलित नंबर प्लेट के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, यह क्योंकि उनके अस्तित्व में मतभेद की, प्रत्येक व्यक्ति सेल लाइन के लिए यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इस वातानुकूलित न्यूरोनल मध्यम बहुत अधिक पतला नहीं है कि यह सुनिश्चित करता है और के रूप में आमतौर पर 50 μl की अधिकतम मात्रा में 30,000 कोशिकाओं, पहले से ही न्यूरोनल संस्कृति के माध्यम से 500 μl जिसमें एक 24 अच्छी तरह से पकवान, के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा जाना चाहिए शर्तों कि प्रत्येक के भीतर अच्छी तरह से, जैसे काफी स्थिर रहना </em> वृद्धि कारकों की एकाग्रता. अच्छी तरह संस्करणों प्रत्येक के लिए अधिक से अधिक से अधिक 50 μl जोड़ने से आम तौर पर न्यूरॉन्स मार डालेंगे.
सह संस्कृति तकनीक के प्रमुख नुकसान में से एक neuronal संस्कृतियों न्यूरॉन्स अपने सामान्य microenvironment से हटा दिया है और उनके सामान्य संरचनात्मक संगठन स्थापित करने में असमर्थ रहे हैं किया गया है जिसका मतलब है कि एक monolayer, के रूप में हो अलग कोशिकाओं से बनाया जाता है. इसलिए वे अन्तर्ग्रथन विकास के प्रारंभिक चरणों प्रभावित कर सकते हैं कि अन्य कोशिकाओं से उचित कनेक्शन, जानकारी और स्रावित अणुओं की कमी है. उदाहरण के लिए, इन विवो मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स घनी इन आदानों striatal ऊतक के विच्छेदन के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं क्योंकि glutamatergic synapses के फार्म नहीं है हमारे neuronal संस्कृतियों में, हालांकि, कॉर्टेक्स, थैलेमस और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में 34 से glutamatergic आदानों द्वारा innervated रहे हैं. कैसे सुसंस्कृत मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स में कार्यात्मक glutamatergic synapses के अभाव AFFECTS GABA एक रुपये व्यक्त एक दूसरे को और / या HEK293 कोशिकाओं के साथ GABAergic synapses के फार्म करने की क्षमता एक खुला प्रश्न बना हुआ है. इस सवाल आसानी से कॉर्टिकल glutamatergic न्यूरॉन्स जिससे उन्हें 35 पूर्व HEK293 कोशिकाओं के अलावा के लिए कार्यात्मक synapses के फार्म के लिए अनुमति के साथ साथ मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स संवर्धन द्वारा संबोधित किया जा सकता है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण परिपक्वता और synapse गठन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है जो cytoarchitecture के कुछ बनाए रखने जो organotypic टुकड़ा संस्कृतियों पर आधारित एक सह संस्कृति मॉडल प्रणाली डिजाइन करने के लिए किया जाएगा. हालांकि, organotypic टुकड़ा संस्कृतियों यहाँ प्रदर्शन विश्लेषण समझौता कर सकते हैं, जो घने और विषम neuropil है. यह एक उच्च पर्याप्त सतह अभिव्यक्ति 30 दी synapse गठन के लिए आवश्यक होने के लिए नहीं दिखाई देता है हालांकि सह संस्कृति assays के उपयोग का एक और महत्वपूर्ण नुकसान, GABA एक रुपये वे न्यूरॉन्स में हैं क्लस्टर नहीं कर रहे हैं HEK293 कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की है. उदाहरण के लिए, आर मेंodent मस्तिष्क और हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों में, α1 GABA एक आर सबयूनिट पिरामिड कोशिकाओं के सभी पोस्टअन्तर्ग्रथनी डोमेन पर सबसे GABAergic synapses में पाया जाता है. हालांकि, α2 विशेष रूप से somata पर synapses और dendrites की एक सबसेट में स्थित है लेकिन इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 36 से पता चला अत्यधिक, अक्षतंतु प्रारंभिक खंड में समृद्ध है. सह संस्कृतियों में synapse गठन अभी भी मज़बूती से पता लगाया जा सकता है कि यह देखते हुए और 30 का विश्लेषण किया, इस HEK293 कोशिकाओं की कोशिका की सतह पर GABA एक रुपये का घनत्व अन्तर्ग्रथनी भीतर इन रिसेप्टर्स के घनत्व की तुलना करने के लिए भी इसी तरह, या और भी अधिक हो सकता है न्यूरॉन्स में समूहों. यह कम से कम इस तरह gephyrin जैसे neuroligin रूप अन्तर्ग्रथनी आसंजन प्रोटीन, और पोस्टअन्तर्ग्रथनी घनत्व प्रोटीन, उचित इकट्ठे GABA एक रुपये पर्याप्त में मौजूद हैं, तो सह संस्कृतियों में synapse गठन के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं क्यों भाग में, व्याख्या कर सकते हैं घनत्व.
यह अच्छी तरह से GABA एक रुपये संरचनात्मक रूप और कार्यात्मक विषम हैं कि दस्तावेज है, और रिसेप्टर सबयूनिट रचना उनके subcellular स्थानीयकरण और औषधीय गुणों को निर्धारित करता है. सबयूनिट लगभग विशेष रूप से उपस्थित extrasynaptic GABA एक रुपये में है जबकि उदाहरण के लिए, 2 सब यूनिटों का समावेश GABA एक रुपये की synaptic स्थानीयकरण के लिए एक शर्त होने के लिए जाना जाता है. केवल संयोजनों αβ शामिल है कि रिसेप्टर्स भी मुख्य रूप से extrasynaptic डोमेन 12- 14 के लिए स्थानीय माना जाता है. इस विशिष्टता हमारे सह संस्कृति प्रणाली में बनाए रखा है चाहे आसानी से क्षणिक neuronal संस्कृतियों को जोड़ने से पहले, स्थिरतापूर्वक α और β सब यूनिटों व्यक्त HEK293 सेल लाइनों में 2 या सबयूनिट cDNAs transfecting द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का उपयोग हमारी प्रारंभिक प्रयोगों synaptic संपर्कों आसानी तकनीक और नवीनता का संकेत है कि केवल 2 सबयूनिट की उपस्थिति में गठन कर रहे हैं कि सुझाव दिया हैvivo में मनाया ficity विट्रो में संरक्षित किए जाने की संभावना है (नहीं दिखाया डेटा).
इसके अलावा, विभिन्न α सब यूनिटों को शामिल GABA एक रुपये चुनिंदा प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार के साथ बनाई synaptic संपर्कों के लिए स्थानीय कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, ग्लोबस पैलिडस में, α1-GABA एक रुपये आम तौर पर striatopallidal (STR-जीपी) और क्रमशः, dendrites और मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स की दैहिक क्षेत्रों पर स्थित हैं जो palliopallidal (जीपी जीपी) अन्तर्ग्रथन, पर पाए जाते हैं. α3-GABA एक रुपये मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स की perisomatic क्षेत्रों में स्थित हैं और इन न्यूरॉन्स के बाहर का डेन्ड्राइट पर स्थित है और स्ट्रिएटम 32 से आदानों द्वारा मुख्य रूप से संपर्क कर रहे हैं α2-GABA एक रुपये, जबकि स्थानीय जीपी अक्षतंतु कोलेटरल से संपर्क कर रहे हैं. Synapses के और अलग न्यूरोनल डिब्बों में विभिन्न प्रकार में विशिष्ट α सब यूनिटों की अभिव्यक्ति भी ऐसे HIPP के रूप में अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रदर्शन किया गया हैocampus 21 और 18,20 नियोकॉर्टेक्स. इन निष्कर्षों विशिष्ट निरोधात्मक synapses के मस्तिष्क में गठन कर रहे हैं के रूप में कैसे सवाल उठा. प्रीसानेप्टिक टर्मिनल के एक विशिष्ट प्रकार के आसंजन संपर्क के अंक में विशिष्ट GABA एक आर उपप्रकार की प्रविष्टि के लिए प्रेरित करता है? रिसेप्टर्स उनकी प्लाज्मा झिल्ली प्रविष्टि विशिष्ट मूल के axonal टर्मिनलों के आसंजन के लिए एक शर्त है जहां उनकी सबयूनिट संरचना, के अनुसार विशिष्ट subcellular स्थानों के लिए तस्करी कर रहे हैं? तिथि करने के लिए, इन सवालों के जवाब अनुत्तरित रह. इस तरह के सह संस्कृति मॉडल प्रणाली के रूप में कम मॉडल प्रणाली का उपयोग करते हैं, प्रणाली महत्वपूर्ण बात, डीएनए निर्माणों और अभिकर्मकों के आवेदन की अभिकर्मक को आसानी से उत्तरदायी है और क्योंकि हमें इस जटिल सवालों का जवाब शुरू करने के लिए अनुमति देते हैं, यह जीना सेल इमेजिंग विश्लेषण के लिए उपयुक्त है 30. इस प्रकार, इस मॉडल प्रणाली का उपयोग कर हम जानते हैं, GABA एक रुपये के विभिन्न प्रकार सहित व्यक्तिगत अणुओं की भूमिका का परीक्षण शुरू कर सकते हैंएन synaptic संपर्कों में उपस्थित होने के लिए. एक और लाभ यह मिनट के भीतर घंटे के लिए तेजी से इस मॉडल प्रणाली के रूप में synapses, प्रयोगों की अवधि को कम करता है. इसी तरह के सह संस्कृति मॉडल प्रणाली सफलतापूर्वक उपन्यास synaptogenic अणुओं 27,37,38 के लिए स्क्रीन करने के लिए अतीत में कार्यरत थे.
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकसित करता है समझ कैसे, परिपक्व और उदाहरण, व्यवहार या अनुभूति के लिए नियंत्रण करने के लिए इतना जटिल न्यूरॉन्स के बीच रूपों कनेक्शन, मौलिक महत्व का है. यह दूर उद्देश्य केवल विकास के दौरान मान्यता और सेल करने वाली सेल संचार के अलग-अलग चरणों है कि सरकार आणविक तंत्र की रूपरेखा द्वारा प्राप्त किया जाएगा. कारण सरासर जटिलता, इन कई सेलुलर बातचीत के आणविक विवरण वर्तमान में केवल कम सिस्टम में परिशुद्धता के साथ अध्ययन किया जा सकता है. हालांकि, क्षमता प्रोटीन के कई संयोजनों को व्यक्त करने और कैसे अध्ययन करके इन प्रणालियों की जटिलता को बढ़ाने के लिएवे उदाहरण के लिए, आनुवंशिक विलोपन दृष्टिकोण, के साथ तुलना में कुछ फायदे हैं बातचीत. एक जीन विलोपन के प्रभाव की सटीक व्याख्या अक्सर विशेष रूप से विकासशील मस्तिष्क में, मूल घावों के प्रभाव मास्किंग प्रतिपूरक तंत्र के साथ जुड़े परिवर्तन से समझौता किया है क्योंकि यह है. यहाँ वर्णित सरल अभी तक जानकारीपूर्ण सह संस्कृति तकनीक synapse गठन में GABA एक रुपये की संरचनात्मक भूमिका की खोज की अनुमति दी और GABA एक रुपये और अन्य सेल आसंजन अणुओं और / या अन्तर्ग्रथनी मैट्रिक्स प्रोटीन एक दूसरे के साथ बातचीत कैसे की जांच के लिए एक संभावना खोल दिया है synaptogenesis दौरान. Synaptic मैट्रिक्स प्रोटीन वे हाल ही में glutamatergic synapse गठन 39 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन किया गया है कि दिए गए विशेष रुचि के हैं. वे 'सामान्य और गाइड जो आणविक तंत्र की हमारे ज्ञान अग्रिम करने की क्षमता है क्योंकि सह संस्कृति मॉडल के आगे विकास के लिए महत्वपूर्ण है# 8217; मस्तिष्क के विकास और इस प्रकार इन तंत्र ऐसे मिर्गी, पागलपन, आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार और कई अन्य लोगों के रूप में कई neurodevelopmental रोगों में बदल रहे हैं की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए.
The authors have nothing to disclose.
हम एमआरसी ब्रिटेन (G0800498) से वित्तीय सहायता स्वीकार करना चाहते हैं. हम भी एंटीबायोटिक प्रतिरोध युक्त pcDNA 3.1 (+) अभिव्यक्ति वैक्टर प्रदान करने के लिए, GABA एक आर सबयूनिट-विशिष्ट γ2 एंटीबॉडी और प्रोफेसर आर हार्वे, फार्मेसी के UCL शिक्षा प्रदान करने के लिए, प्रोफेसर जेएम Fritschy, ज्यूरिख विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहूंगा stably ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 सेल लाइनों के उत्पादन के लिए जीन.
Name | Company/Individual | Catalog Number | Comments |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Serum) | Life Technologies | 11960-044 | Warm in water bath at 37 ° С before use |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Danger: irritant |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10106-169 | |
Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | Warm in water bath at 37 ° С before use |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
HBSS (10X) | Life Technologies | 14180-046 | |
HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | |
PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) | Life Technologies | V790-20 | |
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) | Life Technologies | V860-20 | |
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) | Life Technologies | V870-20 | |
Stable HEKα1β2γ2 line | Sanofi-Synthelabo, Paris | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1149 | |
G418 disulfate salt (Geneticin) | Sigma-Aldrich | G5013 | Danger: irritant |
Phleomycin D1 (Zeocin) | Life Technologies | R25001 | |
Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | Danger: toxic, irritant and corrosive |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | Warm in water bath at 37 ° С before use Danger: Irritant. |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
100 μm Nylon Cell Strainer | VWR | 734-0004 | |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C1768 | Danger: Irritant |
Chelating agent (Versene) | Life Technologies | 15040-033 | |
liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). | Life Technologies | 15338-100 | Alternative transfection method: Effectene Reagent |
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) | Qiagen | 301425 | |
Reduced serum medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 11058-021 | |
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 | Synaptic Systems | 105311C5 | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | |
Sodium Chloride (NaCl) | VWR | 27810.364 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G1726 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody | Prof. Jean Marc Fritschy | N/A | |
(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H. | |||
J. Comp. Neurol. 359 (1) 154–194 (1995). | |||
Triton X-100 | Promega | H5141 | |
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody | Merck Millipore | MAB351 | |
Mouse anti-synapsin antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) | Merck Millipore | MAB341 | |
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody | Professor Anne Stephenson | N/A | |
(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172. | |||
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody | Merck Millipore | AP1085 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | Merck Millipore | AP124S | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody | Life Technologies | A31553 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody | Life Technologies | A21422 | |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Life Technologies | A11008 | |
Mounting reagent (Prolong Gold) | Life Technologies | P36930 | Use at room temperature |