Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.
Her introduserer vi en rekke grundig testet og godt standardiserte forskningsprotokoller tilpasset for bruk i avsidesliggende marine miljøer. Prøvetakings protokoller inkluderer vurdering av tilgjengelige ressurser til det mikrobielle samfunn (oppløst organisk karbon, partikulært organisk materiale, uorganiske næringsstoffer), og en omfattende beskrivelse av de virale og bakterielle samfunn (via direkte viral og mikrobielle teller, telling av autofluorescent mikrober, og bygging av viral og mikrobielle metagenomes). Vi bruker en kombinasjon av metoder, som representerer en spredt felt av vitenskapelige disipliner omfatter allerede etablerte protokoller og noen av de nyeste teknikker utviklet. Spesielt metagenomic sekvense teknikker som brukes for virus- og bakteriesamfunnet karakterisering, er det etablert først i de senere årene, og er dermed fortsatt utsatt for kontinuerlig forbedring. Dette har ført til en rekke prøvetaking og utvalgets behandling prosedyrer kortstly i bruk. Settet av metoder som presenteres her gir en oppdatert tilnærming til å samle inn og behandle miljøprøver. Parametere adressert med disse protokollene gi minimum på informasjon som er viktig for å karakterisere og forstå de underliggende mekanismene for viral og mikrobielle samfunnet dynamikk. Det gir lett å følge retningslinjer for å gjennomføre omfattende undersøkelser og diskuterer kritiske trinn og potensielle begrensninger relevant for hver teknikk.
Marine økosystemer er utsatt for et bredt spekter av forstyrrelser som fører til endringer fra næringsstoffer til biomassen av apex rovdyr. I løpet av det siste tiåret har flere studier vist betydningen av mikrobielle samfunn i marine økosystemer 1-4. Det er tydelig at endringer i bakteriell og viral samfunnet er nært forbundet med den generelle nedbrytning av marine miljøer 5. Disse endringene kan gjøres lettere ved endret geokjemi i vannsøylen som oksygen tilgjengelighet eller karbon remineralization 6,7. Som et resultat av den gjensidige avhengigheten mellom de makro, vannkjemi og mikrobiell aktivitet tilbakekoblingssløyfer kan akselerere hastigheten av degradering 8 økosystemet.
På 1970- og 80-tallet flere forsøk ble gjort for å løse biogeokjemiske sykluser i marine økosystemer 9-11. En av de viktigste utfordringene for disse tidlige studiene var mangelenav standardiserte metoder for å måle de vurderte biogeokjemiske parametre. Selv om det var protokoller tilgjengelig, først og fremst på sjøvanns næringsstoffer 12,13, ble vurderingen av karbondynamikken og mikrobiell samfunnsstruktur begrenset av de verktøy og metoder tilgjengelig. Med JGOFS EqPac metoder sammenligning, 14 Sharp et al., Foreslo for første gang en pålitelig og standardisert protokoll for oppløst organisk karbon (DOC) konsentrasjons vurderinger. Ved begynnelsen av 2000-tallet de analytiske utfordringer å avgjøre ressurser tilgjengelig for den mikrobielle samfunnet hadde dermed vært i stor grad løst og tilnærminger for å karakterisere mikrobielle samfunn i kontrollerte kulturmiljøer hadde blitt etablert (se DeLong 15). De tradisjonelle sekvenseringsmetoder på den tiden i stor grad støttet seg på dyrket klonale kulturer. Tidlig miljø gensekvensering av naturlige prøver viste imidlertid at flertallet av mikrobiell biodiversitet hadde vært savnet av Kulturasjon baserte metoder 16. I 2002 Breitbart et al. 17 brukte hagle sekvensering for første gang å beskrive viral samfunnet i miljøsjøvannsprøver etablere en metode for å sekvensere hele genomet til ukultur marine virus lokalsamfunn.
Innenfor de eksisterende mikrobielle vurderinger, virus fortsatt spesielt under-studert, som de fleste er vanskelige å dyrke og de mangler et universelt konservert markør som 16S ribosomalt RNA (rRNA) gener som vanligvis brukes for å vurdere mangfold og samfunnet profilering. Den metagenomic sekvense tilnærmingen gir et alternativ til kulturavhengig og gen-målrettede metoder for å analysere komplekse virus lokalsamfunn. Mens de første virale metagenomes generert fra sjøvann ble sekvensert med Sanger-sekvensering 17, har utviklingen av neste generasjons sekvensering teknologi og forbedrede molekylære teknikker førte til en rask økning i metagenomic studier 18 </sopp>. Den aktuelle laboratorium arbeidsflyt for viral metagenomikk involverer separasjon, anrikning, og / eller konsentrasjon av viruspartikler, fulgt av nukleinsyre (DNA eller RNA) ekstraksjon, bibliotek preparatet, og sekvense 19-21.
Å videreutvikle det eksisterende kunnskap om virus, mikrobiologisk og biokjemisk funksjon i akvatiske økosystemer, sammenligne datasett i ulike systemer rundt om i verden er avgjørende. Imidlertid har de etablerte protokoller i stor grad blitt utviklet for kystnære miljøer med lett tilgjengelige laboratoriefasiliteter. Således mangelen på standardiserte feltmetoder hindrer disse kryss-økosystem sammenligninger. Her introduserer vi grundig testet og godt standardisert tilpasninger fra state of the art forskningsprotokoller for avsidesliggende felt steder. Har vist seg vellykket i flere studier som spenner over det siste tiåret 5,22 disse metodene, og brukes i dag av ulike marine laboratorier samt på NOAAReef Assessment and Monitoring Program (RAMP) i hele Stillehavet 4. Prøvetakings protokoller inkluderer vannkjemi parametere (uorganiske og organiske karbonkonsentrasjoner, uorganiske næringsstoffer konsentrasjon), viral og mikrobiell overflod (direkte bakterietall, direkte virus teller, og flowcytometri for å vurdere Autotrofi vs Heterotrofi prosenter), og viral og mikrobiell samfunnsstruktur og metabolsk potensial gjennom metagenomic Analyse (for en oversikt se figur 1). Resultatene fra de metodene som er beskrevet her resultatene er nødvendig for å belyse viktige biogeokjemiske bakgrunns parametere som trengs til omfattende karakter akvatiske økosystemer.
De metodene som presenteres her vil gi et verktøy for å generere en helhetlig vurdering av viral og mikrobielle dynamikk i akvatiske økosystemer. De er målrettet for å kvantifisere den stående bestanden av organiske og uorganiske ressurser tilgjengelig for mikrobielle samfunn og å karakter makeup av viral og mikrobielle samfunn stede. Ved siden av å kvantifisere viral overflod og mikrobiell overflod og biomasse, avslører genomisk sekvensinformasjon deres samfunn struktur og funksjon. Alle fremgangsmåter er blitt utviklet eller modifisert for å gi rom for anvendelse i fjernfelt steder. Men mangelen på kontrollerte innstillinger laboratorie skaper iboende visst potensiale for feil. Her diskuterer vi noen begrensninger knyttet til hver av parametrene vurderes. Ved siden av potensialet for forurensning ved håndtering av prøver noen av parametrene også gi muligheter for feil i den analytiske prosessen.
Oppløst organisk karbon
Carbonforurensning kan oppstå i løpet av samplingsprosedyrer (prøvetaking nedstrøms, eller i umiddelbar nærhet av en båt eller dykker), i løpet av prøvepreparering (forurensning av utstyr eller utilsiktet håndtering), og til og med under lagring av prøven (andre prøvene i fryseren inneholdende organiske løsemidler / FLYKTIGE). For å unngå de ulike forurensningskilder oppførsel så få stegene som mulig, som hver prøve flytting utgjør en ekstra kilde til forurensning. Prøven bør ikke komme i kontakt med noen element som ikke er syrevasket eller forbrennes. Til slutt vil utpeke en lagringsplass fryser utelukkende for prøver som ikke inneholder flyktige organiske stoffer sikre integriteten av prøvene ved langvarig lagring. Hvis prøvene ikke kan holdes frossen løpet av en lengre reise periode forsuring av DOC prøver med konsentrert HCl (som beskrevet 38-41) kan være et aktuelt alternativ. Hvis du vil kontrollere målenøyaktigheten DOC konsensusreferansemateriale bør brukes regularly under DOC målingen går. Spesielt dypt sjøvann (> 2000 m) referanser er verdifulle i å vurdere resultatene av den analytiske maskinen til det den er veldig stabil i sin DOC-innhold 42.
Partikkel Organic Matter
I tillegg til å unngå forurensning av organisk karbon, POM prøvetaking krever spesiell oppmerksomhet for å sikre nøyaktigheten av den filtrerte volum. Dersom målrettede volum på 500 ml bør avvike for enhver potensiell grunn dette må bemerkes å forholde mengden POM fanget på filteret til filtratet som den ble hentet.
Uorganiske næringsstoffer
Som med organisk karbon prøvetaking, må det tas hensyn til mulige nærings prøvekontaminering generert av ulike kilder som båter eller avløpsvann 12. Filtrene som brukes for organisk karbon prøvetaking med en nominell porestørrelse på 0,8 mikrometer, kan ikke utelukke all mikrobiell biomasse og shOuld derfor bli endret til 0,2 um filtre for dette filtreringstrinn. Videre deteksjonsgrenser utgjøre et problem med næringsprøver; spesielt i oligotrofe overflatevann rundt mange korallrev steder (f.eks Cotner et al. 43). Deteksjonsgrenser er omtrent rundt 0,1, 0,2 og 0,1 umol / L for ammonium, nitrat og nitritt, og orto-fosfat henholdsvis (se 36,12,37)
Mikroskopi
Ved siden av variasjoner i konsentrasjonen av prøvene bildeanalyse fra mikros glir videre gir potensial for feil. For eksempel kan bildene være ute av fokus i enkelte områder av synsfeltet, og i fokus i andre. Som et høyrent filter aluminamatrise er en meget stiv filtertype, kan en hvilken som helst rusk under filteret føre til at hele filteret for å sitte på en vinkel til sleiden. Som et resultat, kan bildene være konsekvent ute av fokus i ulike deler av synsfeltet for et gitt filter, regardless mikroskop justering. Remontering filtre, noe som sikrer at undersiden av filteret er rent, kan bøte på dette hvis det er observert. Også, i noen tilfeller kan det være to fokalplanene hvori virus og mikrober kan bli funnet. Dette er et resultat av fargede gjenstander løsner fra filteret ved montering, og flyter opp til undersiden av dekkglass som kan foreta tellinger upålitelig. Derfor er det alltid anbefalt å sjekke kvaliteten på prøvene i løpet av prosessen.
Flowcytometrisystemer
Som med de mikroskopi prøver, kan det være naturlig forekommende forskjeller mellom flowcytometri prøver som krever justeringer av den analytiske prosess. For eksempel, avhengig av følsomheten av apparatet, kan svakt Prochlorococcus celler som fluorescerer være under det støynivå, og vil ikke bli kvantifisert. Perler tjene som en intern prøvekontroll (f.eks, for å bekrefte at instrumentets response til fluorescerende signaler er konsekvent fra dag til dag (og forblir stabil under kjøringen i seg selv). Hvis tilsettes til prøven ved kjente konsentrasjoner, kan de også tjene som en intern kontroll for å verifisere at prøvevolum løp. Imidlertid er det anbefalt til alltid å kjøre en alikvot på en tidligere frosset "standard" sjøvannsprøven som blir tint og farget sammen med prøvene av interesse å tilveiebringe en ytterligere biologisk kontroll for prøvehåndtering mellom 96-brønners plate løper. Avhengig av plasseringen, kan sjøvannsprøver ser veldig forskjellige fra hverandre. Sortering "representative" populasjoner og deretter visning under en epifluorescent mikroskop (EM) kan være en god måte å raskt verifisere planteplankton populasjoner som enten Synechococcus sp. Eller foto eukaryoter. Prochlorococcus celler er vanligvis ikke synlig under EM fordi de visne for fort. I tillegg til klorofyll a, Synechococcus sp. Også inneholde photopigment phycoeurythrin (PE), som emitterer lys med kortere bølgelengder (540-630 nm) enn klorofyll A (660-700 nm). Når Synechococcus celler er begeistret med blå / grønt lys (470-490 nm), vil de vises golden hvis sett under en utslippsfilter som fjerner alle bølgelengder av lys under 510 nm. Til sammenligning vil den eukaryote fraksjon let rødt, når eksitert med den samme bølgelengden til lyset.
Viral metagenomikk
Det er viktig å merke seg at prosessen med VLP konsentrasjon og lagring påvirker fellesskap utvinnes. Viruspartikkelen tap kan oppstå på alle trinn i prosessen, og dermed kan valg av virus rensing og berikelse protokoller slutt påvirker den observerte taksonomiske sammensetningen og mangfoldet i de resulterende virus metagenomes 44,45,18. Konsentrasjon av prøvene kan gjøres ved hjelp TFF 19 eller kjemisk-baserte flokkulering 20. I den kjemiske-basert tilnærming, positheving belastet jernioner binder de naturlig negativt ladede virale partikler som danner store (> 8 um) jern-viral komplekser som flokkulerer ut av oppløsningen og kan utvinnes ved hjelp av 8 um filtre. Deretter jernet er chelatert av de virale partikler og re-oppløst ved hjelp av magnesium, askorbinsyre og EDTA, forlater konsentrerte viruspartikler for nukleinsyre-ekstraksjon 20. Etter å sammenligne disse to aktuelle metoder, konkluderte vi med at jernklorid metoden er mindre tidkrevende enn TFF viral konsentrasjon, men kan gi noen begrensninger. Vi fant at dissosiasjon og oppløsning av jern-viral krever en to-ganger mer konsentrert magnesium-askorbinsyre-EDTA-oppløsning enn rapportert 20 i rekkefølge for oppløsning for å fortsette før den askorbinsyre degraderes. Bortsett fra dette problemet, renser protokollen viruspartikler etter størrelse-fraksjone alene, fjerne mikrobielle forurensninger som bruker 0,2 mikrometer filtrering. Store virus ikke passerer gjennom filtER (f.eks Yang et al. 46) og vil således ikke bli detektert i det metagenome, mens noen bakterier (McDole, upubliserte data). Dette resulterer i bakteriell forurensning, mens diskriminerende mot store virus.
Det spesifikke problem er imidlertid også relevant for fjerning av mikrober i forbindelse med TFF konsentrasjon. Som kloroform behandling har vist seg å fjerne kloroform-sensitive virus med eksterne lipidmembraner 47 noen studier antyder at 0,22 um filtrering kan brukes for å fjerne de fleste bakterier. Det skal også bemerkes at den presenterte fremgangsmåten først og fremst er rettet mot bakteriofag, det mest tallrike bærer av genetisk materiale i marine miljøer. Fordi fagen er generelt antatt ikke å inneholde vanlig lipider 48 de er mer motstandsdyktige mot kloroform behandling. Så vidt vi vet en "catch-all" metoden ikke eksisterer til dags dato. Metoden som presenteres her er tilpasset fra our felterfaring i løpet av de siste 10 årene i ulike marine miljøer som spenner over tropisk til arktisk systemer.
Microbial metagenomikk
Byggingen av metagenomic biblioteker for mikrober (dvs. bakterier og Archaea) er mer oversiktlig enn virale metagenomes som det er lettere å generere minimal DNA-konsentrasjoner som kreves for biblioteket forberedelse. Linker forsterkning hagle biblioteker (LASLs) 17,49,50 og hele genomet forsterkning basert på multiple forskyvning forsterkning (MDA) er de to mest brukte metoder for å generere tilstrekkelig DNA for sekvensering. Bruken av MDA å oppnå høyere konsentrasjoner i DNA-mikrobielle metagenomes er noen ganger nødvendig. Dette kan imidlertid føre til artefakter i sekvensdataene, for eksempel overforsterking av dinoflagellat minicircles. MDA fremgangsmåter er kjent for å forsterke fortrinnsvis enkelt-trådet og sirkulært DNA, noe som resulterer i ikke-kvantitative resultater 51,52. Den optimaliserte LASLs nærmer 50 kan dermed fungerer som et bedre alternativ i å forsterke både mikrobiell og viral metagenomic DNA for sekvensering. Det er viktig å merke seg at LASLs tilnærmingen har flere trinn, krever sofistikert utstyr, og er begrenset til dsDNA-maler. Videre har vevet DNA-ekstraksjon kit vist seg å trekke ut DNA fra både Gram positive og Gram negative phyla, men det har ikke blitt bekreftet å effektivt Lyse trassig mikrobiell taxa eller tilhørende strukturer (f.eks viss archaea, endospores eller soppsporer) . Derfor er en vibrerende kuletrinn kan være nødvendig for å oppnå DNA fra visse mikrober.
Disse omfattende vurderinger vil føre til en bedre forståelse av viral og mikrobiell økosystemet. Selv om få studier har påtatt seg arbeidet med å vurdere alle foreslåtte parametere, mange har vært etterforsket utvalgte. Nelson et al., Foreslo en 53 forbindelse kroneen bestemt rev habitater og nedbryting av både DOC og bacterioplankton konsentrasjoner i forhold til offshore farvann. Disse konsentrasjons endringer ble ledsaget av forskjellige differensieringer av bacterioplankton lokalsamfunn. Dinsdale et al. 5 viste at økt menneskeskapt påvirkning ble ledsaget av 10x høyere Forekomsten av mikrobielle celler og viruslignende partikler. Mikrobielle samfunn i marine farvannene rundt bebodde øyene hadde også større fraksjoner av heterotrophs og potensielle patogener 5. Endelig McDole et al. 4 viste, ved å innføre den microbialization stillingen, at menneskelige aktiviteter er skiftende energi til mikrobene, på bekostning av de macrobes. Disse studiene, rettet mot ulike mikrobielle og vannkjemi parametere, gi ny innsikt i den biokjemiske struktur av marine økosystemer. Kombinerer tradisjonelle data av økosystemet overvåking innsats – som temperatur og pH-verdier, fiskebiomasse og diversity, bentiske cover, eller eksponering for menneskelig påvirkning – med vannkjemi og mikrobielle vurderinger, vil trolig føre til mer sensitive miljøovervåking innsats, noe som kan føre til mer målrettede naturvernarbeid.
The authors have nothing to disclose.
We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
Filtration setup | Figure 1 | ||
32 – 36 % Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
Combustion oven (550° C) | |||
60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
20 l collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
0.2 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
8.0 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
0.22 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
0.45 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
20 ml plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
Clean bucket (10 – 20 L) | |||
32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
25 % glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
Liquid Nitrogen | |||
0.02 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
0.2 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
DAPI solution 25 µg ml-1 | Invitrogen | D1306 | |
Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
Ascorbic Acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
Slide Station with vacuum pump | Figure 3 | ||
DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
Proteinase K (20 mg ml-1) | Lifetechnologies | AM2546 | |
200-proof 100% Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
60 ml syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
0.02 µm alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
Ultra – swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
DNase I (100 u µl-1) | Calbiochem | 260913 | |
0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
100 % Ethanol (200-proof) | Electron Microscopy Science | 15058 | |
1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
20 μg ml-1 Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
50ml Oak Ridge Tube | Fisher Sci | 05-562-16B |