Timectomia completo em ratos adultos com não-invasiva entubação endotraqueal

Summary

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Abstract

Timectomia em roedores neonatais é um procedimento estabelecido e confiável para estudos imunológicos. No entanto, em ratos adultos, complicações de hemorragia e pneumotórax de ruptura pleural pode resultar numa taxa de mortalidade significativa. Este protocolo é um método simples de thymectomy rato que utiliza um mini-esternotomia e entubação endotraqueal. Intubação é realizado com um método não-invasivo e de fácil reprodução e permite a ventilação com pressão positiva para evitar pneumotórax e uma via aérea controlada que permite tempo suficiente para a dissecção timo cuidado para minimizar a interrupção pleural. A 1,5 centímetros incisão esternal diminui o contato com os vasos do mediastino e pleura, enquanto ainda fornece a visualização completa do timo. Após a exposição do mediastino, o timo é removido por dissecção romba sob ampliação. O espaço pleural é então selado por fecho de sutura dos músculos pré-traqueal, seguido pela aplicação de cola cirúrgica. Otórax é então fechada por sutura de encerramento do esterno, seguido por fecho de sutura da pele. Todos os timectomias estavam completos como evidenciado pela imuno-histoquímica (IHQ) coloração de tecidos do mediastino, e ausência de células T naive por citometria de fluxo, e que o processo tinha uma taxa de sobrevivência de 96%. Esse método é apropriado quando a timectomia completa com o mínimo de complicações é desejado para mais estudos imunológicos em ratos atímicos adultos.

Introduction

Desde o início da década de 1960, o timo foi reconhecido o papel crítico no desenvolvimento da tolerância imunológica central. Roedor timectomia provou ser um processo essencial para definir o papel do timo na diferenciação de linfócitos, a auto-tolerância, e imunotolerância na definição de transplante aloenxerto e metástase do tumor. A remoção do timo do rato permite a estudos que envolvem a depleção de células T ou a transferência adoptiva de populações de células T definidos, sem o reaparecimento de células T naive nativas.

Timectomias em roedores neonatais pode ser realizada utilizando uma técnica de sucção com resultados fiáveis ^​​1. Em ratos adultos, esta técnica está associada com uma taxa de mortalidade de 20% e, frequentemente, resulta em uma timectomia ² incompleta. Para alcançar consistentemente thymectomy completo em ratos adultos, é necessária a exposição aberta do mediastino por esternotomia mediana. No entanto, esteprocedimento está associada a complicações que incluem lesão traqueal, hemorragia e pneumotórax levando a uma taxa global de mortalidade variando 1,5-6% ^{2- 4.}

Ao longo das duas últimas décadas melhorias nas técnicas de timectomia diminuíram complicações perioperatórias e melhoraram as taxas de sobrevivência. A entubação endotraqueal permitindo a ventilação com pressão positiva diminuiu as taxas de pneumotórax ^5. Métodos de intubação anteriormente descrito gama de exposição aberta ao traquéia para métodos menos invasivos, utilizando a visualização direta das cordas vocais. As complicações associadas ao procedimento de intubação traqueal incluem lesão, a ruptura das cordas vocais, intubação esofágica não intencional, e hemorragia decorrente da punção cardíaca ou laceração da veia cava superior. Além disso, a proximidade dos lobos do timo mais baixos para o revestimento pleural podem resultar em pneumotórax.

Aqui nós descrevemos uma técnica dethymectomy através de um minimamente invasiva dois centímetros da pele incisão na sequência de um método simples de entubação endotraqueal usando um angiocateter embotados-end e iluminação traqueal transcutânea. O thymectomy envolve um 1,5 centímetros sternotomy e um encerramento de três camadas com aplicação de cola cirúrgica para selar o mediastino e minimizar a incidência de hemorragia e complicações respiratórias. Este método resulta de forma fiável, timectomia completa, como evidenciado pelo desaparecimento das células T ingénuas CD4 ⁺ e CD8 ⁺ a seguir a timectomia e a ausência de tecido do timo de coloração IHC. Tempos operatórios e mortalidade peri-processual são mantidos a um mínimo.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos experimentais que envolvam a utilização de ratos foram feitas de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado e uso Comitê da Universidade de Duke Animal. 1. Preparação da intubação traqueal Cannula Corte a ponta da agulha de um 2 polegadas 14 G angiocathether agulha com alicate de corte. Comprima o lúmen da agulha fechado com alicate de bico. Corte a parte comprimida para baixo à extremidade da porção de lúmen aberto…

Representative Results

Este procedimento foi realizado em ratos Lewis adultos (n = 26). O tempo médio de operação foi de 15 ± 3 min. Não houve mortalidade intra-operatória. O tempo de intubação média – de colocação de rato em cima do aparelho de intubação para o estabelecimento da ventilação – foi de 45 ± 5 segundos. 24 ratos tiveram uma recuperação completa da operação, sem evidência de dificuldades respiratórias ou hemorragia através dia de pós-operatório (DPO) 14. Um rato desenvolvido dificuldade respiratória em P…

Discussion

O presente protocolo para thymectomy completa fornece uma abordagem minimamente invasiva com um fecho de incisão de três camadas com aplicação de cola cirúrgica projetado para minimizar as complicações. A remoção completa do timo foi demonstrado pela perda de células T naive e por IHC coloração do tecido linfóide do mediastino para citoqueratina.

O procedimento de thymectomy rato adulto tem sido complicada por taxas de mortalidade variando de 1,5 – 20% devido a complicações pe…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
2" 14-gauge angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator)and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity Fiber-Optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35