Wir beschreiben eine Methode zur Generierung eines möglichen Zebrafischmodells der polyzystischen Nierenerkrankung. Wir verwendeten Tg(wt1b:GFP)-Fische, um die Nierenstruktur sichtbar zu machen. Der Knockdown von wnt5a erfolgte durch Morpholino-Injektion. Die Bildung pronephrischer Zysten nach wnt5a-Knockdown wurde bei diesem GFP-transgenen Zebrafisch beobachtet.
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Methodenartikel
Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von Wnt5a Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist eine der häufigsten Ursachen für Nierenerkrankungen im Endstadium, eine verheerende Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Die molekularen Mechanismen, die zur Zystenbildung bei PKD führen, sind noch etwas unklar, aber es wird angenommen, dass viele Gene beteiligt sind. Wnt5a ist ein nicht-kanonisches Glykoprotein, das eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen reguliert. Wnt5a wirkt über den planaren Zellpolaritätsweg (PCP), der die orientierte Zellteilung während der renalen tubulären Zellverlängerung reguliert. Es wurde festgestellt, dass Defekte des PCP-Signalwegs die Bildung von Nierenzysten verursachen. Unsere Arbeit beschreibt eine Methode zur Entwicklung eines Modells für zystische Nierenerkrankungen im Zebrafisch durch Knockdown des wnt5a-Gens mit wnt5a-Antisense-Morpholino (MO)-Oligonukleotiden. Tg(wt1b:GFP) transgene Zebrafische wurden verwendet, um die Nierenstruktur und Nierenzysten nach dem wnt5a-Knockdown sichtbar zu machen. Es wurden zwei unterschiedliche Antisense-MOs (AUG - und Spleißstelle) verwendet, die beide zu einem Curly Tail Down-Phänotyp und zur Zystenbildung nach wnt5a-Knockdown führten. Die Injektion von Maus-Wnt5a-mRNA, die aufgrund eines Unterschieds in der primären Basenpaarstruktur resistent gegen die MOs ist, rettete den abnormalen Phänotyp und zeigte, dass der Phänotyp nicht auf "Off-Target"-Effekte des Morpholino zurückzuführen war. Diese Arbeit unterstützt die Validität der Verwendung eines Zebrafischmodells zur Untersuchung der wnt5a-Funktion in der Niere.
Einleitung
Zebrafisch (Danio rerio) Embryonen wurden allgemein als Modell für die Untersuchung der Nierenentwicklung und polyzystische Nierenerkrankung verwendet. Es gibt viele Vorteile der Verwendung von Zebrafisch als Tiermodell: Die Durchführbarkeit Studium genetischen Wechselwirkungen, die Fähigkeit, Antisense-Morpholino (MO) für die Proteinzuschlags verwenden, die Möglichkeit, schnell zu testen große Anzahl von Embryos und die Betrachtung Organ Phänotypen lebenden Larven 1. Die Vorniere ist die erste Niere bei Wirbeltieren entwickeln und ist funktional in Zebrafisch-Larven 2. Die Struktur der Zebrafisch pronephros ist relativ einfach im Vergl....
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Protokoll
HINWEIS: Ethik Hinweise: Alle Zebrafisch-Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Eastern Virginia Medical School zugelassen.
1. Morpholino Vorbereitung
- Design und Synthese Übersetzung blockier (Aug-) und Spleiß-Hemmung (Spleiß-) Antisense-Morpholino (MO) Oligonukleotide für das Gen von Interesse nach Herstellerangaben (1A). Bitte lesen Sie Informationen des Herstellers, die in Tabelle 1.
HINWEIS: MOs werden als lyophilisierte Aktien in Glasflaschen geliefert. - Hinzufügen hochwertigen sterilem Wasser auf die Glasflasche zu resuspendieren MOs zu einer Endkon....
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Ergebnisse
Wnt5a niederschlagen wurde durch die Einführung Übersetzung blockieren MO erreicht (August-MO) oder Exon / Intron-Grenze Splice-MO (Splice-MO) auf Zebrafischembryonen an dem einen Zellstadium. Die August-MO zielt auf das Start-Codon und daher hemmt sowohl von Müttern und zygotischen Wnt5a Nachricht. Der Spleiß-MO zielt die dritte Spleißdonorstelle und hemmt nur die zygotischen Transkript Wnt5a (1A). Die Aug- und Spleiß- morphants phenocopied seitig mit mehreren Mängeln, darunter Ringel.......
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Diskussion
Polyzystische Nierenerkrankung (PKD) ist eine der führenden Ursachen für end-stage renal Krankheit beim Menschen und wird durch fortschreitende Zysten, Nieren Erweiterung und abnorme Entwicklung Röhrchen 14 aus. Autosomal dominante PKD (ADPKD) ist eine Erbkrankheit, bei der die Mutation von entweder PKD1 kodiert Polycystin-1 (PC1) oder PKD2, Polycystin-2 (PC2) kodiert, führt zu Zystennieren. Viele andere Gene, vor allem Proteine, die in der primären Zilien gefunden codiert, wird angenommen, dass bei der Entwi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die NIH (DK093625 an LH und DK069909 und DK047757 zu JHL) und die VA (Merit Award I01BX000820 zu JHL). Wir möchten Dr. Michael Pack und Dr. Jie er für die Bereitstellung wesentlicher Unterstützung danken an der Universität von Pennsylvania Zebrafisch-Core.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5% Phenol-Rot | Sigma P0290 | Farbindikator für die Injektion | |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (kundenspezifisch) | Kundenspezifisch entwickelt für das Gen von Interesse |
| Vorgezogene Nadel | Tritech Research MINJ-PP | Wenn eine große Menge an Nadel benötigt wird, können Sie auch einen Nadelabzieher erwerben und die Nadel im Labor | |
| vorbereiten T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | Für die In-vitro-Transkription zur Herstellung von gekapselter mRNA für das Rettungsexperiment |
| N-Phenylthioharnstoff | Sigma | P7629 | Zur Vorbeugung der Melanisierung |
| Tricain | Sigma | A5040 | Auch Ethyl-3-aminobenzoat genannt, für die Anästhesie von Zebrafischen |
| Methylcellulose | Sigma | M-0387 | Für die Position des Zebrafisches |
| QIAquick PCR-Aufreinigungskit | Qiagen | 28104 | Zur Aufreinigung von PCR-Produkten für die Kappen-RNA-Synthese. |
| dNTP-Mischung | Promega | U1511 | Für PCR |
| Tag DNA-Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | Für PCR |
| NanoDrop-Spektralphotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | Zur Messung der Morpholino- und RNA-Konzentration |
| Luftkompressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Luftquelle für die Injektion |
| Pico Mikroinjektionspumpe | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Andere Arten von Mikroinjektionssystemen können verwendet werden. |
| Mikrohersteller | World Precision Instruments Inc | MMJR | Rechtshänder (MMJL für Linkshänder) |
| Nadelhalter | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | Zum Halten der Nadel für die Mikromanipulation |
| Dumont Pinzette | Feine chirurgische Werkzeuge | 11253-20 | Zum Abbrechen der Nadelspitze |
| Präpariermikroskop | Leica M205C | Zur Beobachtung und Bildgebung von Zebrafischembryonen | |
| Fluoreszenzmikroskop | Zeiss Axio Obserer D1m | Für die Bildgebung von Zebrafisch-Pronephros | |
| Kapillarrohr (I.D. 0,15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | Zur Messung des Volumens jedes injizierten Tropfens |
Referenzen
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn
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Nachdrucke und Genehmigungen
