Высокая техника Пропускная Флуорометрический по оценке фагоцитоз макрофагов и полимеризации актина
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
Цель флуорометрического анализа, чтобы служить в качестве эффективного, экономически эффективным, высокой метода пропускной анализа фагоцитоз и другие клеточные процессы. Этот метод может быть использован на различных типах клеток, как адгезивные и не адгезивные, чтобы изучить различные клеточные свойства. При изучении фагоцитоза, флюорометрический техника использует фагоцитарных типов клеток, таких как макрофаги и флуоресцентно меченых частиц, опсонизированных флуоресценции может быть погашен в присутствии трипанового синего. После обшивки адгезивных макрофагов в 96-луночных планшетах, флуоресцентных частиц (зеленый или красный) и вводят клетки позволили фагоцитируют для различных количеств времени. После интернализации люминесцентных частиц, клетки промывают трипановым синим, что облегчает исчезновение флуоресцентного сигнала от бактерий, которые не интернализированных, или просто прилипших к поверхности клетки. После промывки трипанового, клетки промывают PBS с фиксированной,й окрашивали DAPI (ядерная Blue Label люминесцентные), который служит для обозначения ядра клеток. Простым флуорометрического количественного через пластины чтения ядерной (синий) или частицы (красный / зеленый) флуоресценции можно рассмотреть соотношение количества относительных флуоресценции единиц зеленый: синий и определить фагоцитарную индекс, указывающий на количество люминесцентных бактерий интернализованных на ячейку. Продолжительность анализа с использованием 96-луночного метод и многоканальные пипетки для стирки, от конца до конца фагоцитоза сбора данных, меньше, чем 45 мин. Проточная цитометрия может быть использован таким же образом, но преимущество флуорометрии является его высокая пропускная способность, быстрый метод оценки с минимальным манипуляции образцов и быстрого количественного определения интенсивности флуоресценции на клетку. Аналогичные стратегии могут быть применены к не прилипшие клетки, живые меченых бактерий, полимеризации актина и, по существу любой процесс с использованием флуоресценции. Таким образом, флюометрия является перспективным методом его низкой стоимости, высокой throughpут возможности в изучении клеточных процессов.
Introduction
Количественное определение флуоресцентного сигнала широко используются во множестве научных методов, начиная от ПЦР, проточной цитометрии, конфокальной микроскопии и FRET анализ ELISA для мультиплексирования. Флуоресценции изображений и количественное имеет широкое применение и могут быть отличным инструментом для количественного анализа различных клеточных процессов. Использование флуоресцентных маркеров и их сигнал был революцию в последнее десятилетие, и появление люминесцентных читателей плит способствовало высокой пропускной количественного флуоресценции, испускаемого при клеточных процессов.
Флуорометрический анализ может служить отличным инструментом в количественной фагоцитоза. Фагоцитоз был изучен с момента открытия фагоцитов по Мечников в 1800 1. На протяжении многих лет, различные методы были использованы для изучения этого важного процесса важное значение для иммунной защиты против вторжения бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных патогенов 2-5, Предыдущие методы количественного используется микроскопии и стереологических методов для того, чтобы визуализировать клетки, которые phagocytosing, которые затем были количественно путем подсчета интернализованных частиц (вручную или с использованием программного обеспечения) 6-8. Некоторые недостатки использования микроскопа сами по себе для количественного анализа является то, что ручного подсчета бактерий является трудоемким и более склонны к предвзятости наблюдателя. Другой метод, используемый в количественного фагоцитоза является микробиологическое методика обшивки бактерий из клеточных лизатов (следующих фагоцитоза) на бактериальной культуры пластин, но этот метод может не учитывать бактерицидных механизмов и наличием частично интернализированных бактерий. Этот метод еще более трудоемким по сравнению с микроскопией и занимает несколько дней, чтобы анализировать. Проточной цитометрии, кажется, самый быстрый, самый эффективный способ количественного фагоцитоза и была использована многими группами 9-11, но высокая стоимость обычно ассоциируется с инструмент, необходимые для их анализа делает наиболее дорогой метод по сравнению с ранее упомянутых анализов.
Флуорометрический метод хорошей альтернативой проточной цитометрии для анализа интернализации частиц, так как он предлагает объективную количественную оценку флуоресценции с использованием оборудования, которое не так препятствующая стоимость. Другие дополнительные преимущества флуорометрии являются высокая эффективность и высокие возможности пропускную способность для количественной оценки флуоресценции мечеными интернализованных частиц.
Преимущества флуорометрии могут быть экстраполированы на количественной оценки других, чем фагоцитоза процессов. Например, флуорометрического анализа могут быть применены для изучения любой процесс, приводящий к изменениям в экспрессии внутриклеточной или мембраносвязанных рецепторов, изменений в клеточной проницаемости / жизнеспособности, трансфекции эффективности и модуляции в полимеризации актина. Один недостаток флуорометрического техники является то, что, в зависимости от меток, используемых, может быть высокойэксперимента к эксперименту изменчивость, которая, как правило, могут быть решены путем демонстрации данных через относительные количественного, таких как изменение раза или увеличения от контроля процентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основные ограничения флуорометрического техники являются экспериментальными дисперсия, а также потеря клеток, связанная с тщательной промывки и использования не прилипшие клетки.
Разница наблюдается в основном за счет изменения флуоресцентных частиц, как взвешивани…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. . Janeway’s Immunobiology. , (2012).
- Burke, D. W., O’Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
