Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
O objectivo da análise fluorométrico é para servir como um custo eficaz, eficiente método de transferência, a análise de alta fagocitose e outros processos celulares. Esta técnica pode ser usada em uma variedade de tipos de células, tanto aderentes e não aderentes, para analisar uma variedade de propriedades celulares. Ao estudar a fagocitose, a técnica utiliza fluorométrico tipos de células fagocíticas, tais como macrófagos, e partículas opsonizadas marcados com fluorescência cuja fluorescência pode ser extinto na presença de azul de tripano. Após plaqueamento de macrófagos aderentes em placas de 96 poços, as partículas fluorescentes (verde ou vermelha) são administrados e células são deixadas a fagocitose por montantes variados de tempo. Após internalização de partículas fluorescentes, as células são lavadas com azul de tripano, a qual facilita a extinção do sinal de fluorescência a partir de bactérias que não são internalizadas, ou são apenas aderem à superfície da célula. Após a lavagem de tripano, as células são lavadas com PBS, fixadas, umand coradas com DAPI (marcador fluorescente azul nuclear), que serve para etiquetar os núcleos de células. Por uma quantificação fluorometric simples através de leitura de placas de nuclear (azul) ou partícula (verde / azul) fluorescência podemos examinar a proporção de unidades de fluorescência relativa de verde: azul e determinar um índice fagocitário indicativo de quantidade de bactérias fluorescentes internalizadas por célula. A duração do ensaio utilizando um método e multicanal 96 poços pipetas para a lavagem, a partir da extremidade de fagocitose ao fim de aquisição de dados, é inferior a 45 min. A citometria de fluxo pode ser usado de uma maneira semelhante mas a vantagem de fluorometria é o seu elevado rendimento, o método de avaliação rápida com o mínimo de manipulação de amostras rápida e quantificação da intensidade de fluorescência por célula. Estratégias similares podem ser aplicados para as células não aderentes, as bactérias marcadas vivo, a polimerização da actina, e essencialmente qualquer processo utilizando fluorescência. Portanto, fluorometria é um método promissor para o seu baixo custo, alta throughpcapacidades ut no estudo de processos celulares.
Introduction
Quantificação do sinal fluorescente tem sido amplamente utilizado em uma infinidade de métodos científicos que vão de PCR, citometria de fluxo, microscopia confocal, e se aflige análise multiplex ELISA. Imagens de fluorescência e quantificação tem uma ampla aplicação e pode ser uma ótima ferramenta para análise quantitativa de vários processos celulares. A utilização de marcadores fluorescentes e o seu sinal foi revolucionada na última década, e aparecimento de leitores de placas fluorescentes facilitou a elevada taxa de transferência de quantificação de fluorescência emitida durante processos celulares.
Análise Fluorometric pode servir como uma grande ferramenta na quantificação de fagocitose. A fagocitose tem sido estudada desde a descoberta dos fagócitos por Metchnikoff em 1800 1. Ao longo dos anos, uma grande variedade de métodos têm sido utilizados para examinar este processo importante essenciais para a defesa imune inata contra a invasão bacteriana, virai, fúngica e parasitas patogénicos 2-5. Os métodos anteriores de microscopia de quantificação utilizados e técnicas de estereologia, a fim de visualizar as células que são fagocitando, que foram, então, quantificada por contagem de partículas internalizadas (manualmente ou com o uso de software) 6-8. Algumas desvantagens de usar microscopia sozinho para análise quantitativa são de que a contagem manual de bactérias é um trabalho intensivo e mais propenso a viés do observador. Outro método utilizado na quantificação da fagocitose é a técnica microbiológica de chapeamento de bactérias a partir de lisados celulares (após fagocitose) em placas de cultura de bactérias, mas este método pode não têm em conta os mecanismos de bactericidas e presença de bactérias parcialmente internalizados. Este método é ainda mais trabalhosa em comparação com microscopia e demora vários dias a analisar. A citometria de fluxo parece ser a forma mais rápida e mais eficaz para quantificar a fagocitose e tem sido utilizado por vários grupos de 9-11, mas o custo elevado comumente associada com o nostrument necessários para a análise faz com que seja o método mais caros quando comparados com os ensaios mencionados anteriormente.
O método fluorometric é uma boa alternativa para a citometria de fluxo para análise de partículas internalização uma vez que oferece quantificação imparcial de fluorescência usando equipamento que não é tão custo proibitivo. Outros benefícios adicionais de fluorometria são de alta eficiência, e recursos de alto rendimento para quantificar fluorescência emitida pelas partículas internalizados marcados.
Benefícios de fluorometria pode ser extrapolada para a quantificação de outros processos de fagocitose. Por exemplo, a análise fluorométrico pode ser aplicada ao estudo de qualquer processo que conduza a alterações na expressão intracelular ou de receptores ligados a membranas, as alterações na permeabilidade celular / viabilidade, a eficácia de transfecção, e modulação em polimerização da actina. Uma desvantagem da técnica fluorométrico é que, dependendo das etiquetas utilizadas, pode haver um elevadoexperiência para experiência variabilidade que normalmente pode ser resolvido através da demonstração de dados por meio de quantificação relativa, como a mudança vezes ou por cento de aumento do controle.
Protocol
Representative Results
Discussion
As principais limitações da técnica são fluorométrico de variação experimental, bem como a perda de células associadas com a lavagem e a utilização de células não-aderentes extensa.
A variação é observada em grande parte devido à variação em partículas fluorescentes como pesagem e pipetagem durante a preparação da solução não é uma maneira exata de manutenção de números idênticos de partículas de experiência para experiência. Para resolver o problema da varia?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
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