This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Granulocyter utgör en komponent i kroppens medfödda immunförsvar, vilket ger den första försvarslinjen mot invaderande antigener. Tidigare metoder för att bedöma granulocyt funktion med fokus på fagocytos kapacitet eller oxidativ burst använder separata metoder, vilket gör det svårt att avgöra kollektivt hur granulocyter har förändrats 1-4. Framsteg inom flödescytometri har resulterat i produktionen av stationär instrument som kan högupplösta, flerfärgade avbildning av celler i en hög genomströmning sätt 5. Möjligheten att kombinera avbildning med traditionell flöde representerar cytometry ett framsteg som ger den tekniska plattformen som behövs för att förnya inom befintlig flödescytometri metoder och extrahera ny information om immunsystemet.
Under de senaste tio åren har vårt laboratorium, bland andra, varit livligt fokuserat på effekten av olika närings- och motionsbehandlingar patterns på medfödda immunfunktion 6-9. Metoden demonstreras i detta manuskript har praktiska konsekvenser inom området klinisk immunologi. Föreliggande metod utnyttjar kraften i bildbaserad flödescytometri för att samtidigt mäta fagocytos av bakteriella partiklar och oxidativ burst. Med hjälp av denna metod, är en möjlighet att skilja aktiverade granulocyter använder variabler tillhandahålls av bildbaserade delen av analysen. Dessa undergrupper var bara identifieras efter att ha bedömt de cellulära bilderna på de individuella granulocyter. Ytterligare analys inkubationstid påverkade övergången mellan de tre aktiveringsgrupper 10. Sålunda är det troligt att användningen av flera inkubationstider kan tillåta en metod för att testa förändringen i granulocyt funktion efter en specifik experimentell behandling. Syftet med detta manuskript var att demonstrera en metod för att bedöma granulocyt funktion genom att använda bildbaserad flödescytometri att samtidigt mäta fagocytos med oxidative brast.
Den nuvarande metoden innebär en förfining av befintliga metoder för bedömning av granulocyt funktion med hjälp flödescytometri 1,3,4,12-14. De kritiska stegen i denna analys tenderar att vara relaterade till korrekt blandning av blodprovet med biopartiklar och DHE. Ofullständig blandning kommer att resultera i felaktiga resultat. Medan fullständig blandning är kritisk, bör blandningsmetoden vara varsam i naturen. Det föreslås att blandning åstadkommas med användning av en elektronisk pipett med en blandningsfunktion snarare än en virvelblandare. Ett annat kritiskt steg i analysen är att alltid se till att det inte finns något blod förorena den övre halvan av analysröret. Denna resterande blod kan tas bort med en steril bomullspinne. Fullständigt avlägsnande är viktigt eftersom underlåtenhet att göra detta kan kontaminera det slutliga analys beredningen med un-lyserade röda blodkroppar.
Innan du använder den här metoden lämpliga kontroller ersättning bör läggas att kontrollera för spectral överlappning mellan de reagens som används för att identifiera de olika aspekterna av granulocyt funktion. För denna metod, kontroller ersättnings involverar samla blodprov som har föreslagits i 40 min analys inkubation och därefter märkning med en enda markör (dvs, E. coli, DHE, etc.). Efter märkning, är enstaka positiva händelser samlas in och en kompensationsmatris genereras med hjälp av en automatiserad guiden i IDÉER analysprogram. Det är viktigt att om denna analys används är lämpliga kontroller ersättning kompletteras för att säkerställa att analysen fungerar.
Analys sker med hjälp av funktionen finder och co-lokalisering guider för att identifiera att ljusa detaljnivån är den bästa variabeln att separera befolkningen och även identifiera hur mycket överlappning finns mellan oxidativ brast och fagocytos signaler. Det är särskilt användningen av bildbaserad cytometri förutsatt förmågan att segregera aktiverade granulocyter i tre undergrupper. Thans delmängd fördelning bestämdes med hjälp ljusa detaljintensitet fagocytos vs oxidativ burst. Förutom att undersöka dessa singular cellfunktioner, celler som uppvisade båda händelserna samtidigt i samma anatomiska läge (samlokalisering) identifieras. Granulocyter som föll in i "high-aktiv" delmängd var den enda fenotyp som visade konsekvent samlokalisering mellan fagocytos och oxidativ burst. Denna identifiering av aktiverade granulocyter delmängder är det största området där felsökning behövs. Det är mycket viktigt för en ny användare att ta tid att förstå provprocessen arbetsflödet i idéer och att förstå mekaniken i grinda cellpopulationer med hjälp av bildkomponent. Andra ändringar som en användare kan försöka göra inkluderar val av alternativa eller kompletterande analys inkubationstider. Den nuvarande metoden föreslår användningen av varaktigheter av 10 till 40 min; dock beroende på den experimentella modellen där denna metod ärsom skall användas, kan det vara nödvändigt att välja längre analys löptider. En sådan ändring skulle behöva utvärderas på individuell basis.
Vidare bestämdes att varaktigheten av analys inkubation har en betydande inverkan på utseendet på de tre aktiverade delmängder. Den strategi som beskrivs i denna rapport utgör en förlängning av vilken information kunde tidigare erhållna beträffande granulocyt funktion 3,4,13,15. Andra laboratorier har visat på vikten av att bedöma förändringar i granulocyt funktion som en del av en övergripande bedömning av immunitet och sjukdom 15-17. Trots potentialen i denna analys är det inte utan begränsningar. En av de största begränsningarna är kostnad och tid efterfrågan förknippad med hög provgenomströmning. När en studiedesign kräver ett stort antal prov i en viss dag, kan dessa vara svåra att bearbeta. Bearbetning rationaliseras genom användning av elektroniska pipetter och automater,men dessa tenderar att vara dyra och är inte alltid tillgängliga på alla laboratorium.
Vår forskningsområde fokuserar på en studie av hur motion och kostvanor påverkar immunsystemet hälsa och fungera 6,8-10,18-20. Sådana mål har betydande praktiska konsekvenser för en rad olika områden av människors hälsa. Bortom studiet av motion och näringsmässiga effekter av fagocytos metoden demonstreras i detta manuskript kan vara användbar i andra områden av klinisk immunologi där övervakningen av fagocytos funktionen är avgörande för behandlingsresultat. Föreliggande analys är den första av många att immunologiska analyser med potential att vara re-uppfunnen av att fördelarna med den unika bildinformation som kan vara kan från en bildbaserad flödescytometer.
The authors have nothing to disclose.
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
7AAD | EMD Millipore | ||
Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |