छवि आधारित फ्लो तकनीक granulocyte फंक्शन में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए<em> इन विट्रो</em
Summary
This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.
Abstract
Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).
Introduction
Granulocytes हमलावर एंटीजन के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करता है जो शरीर की सहज प्रतिरक्षा प्रणाली, के एक घटक का प्रतिनिधित्व करते हैं। Granulocyte समारोह का आकलन करने के लिए पिछले विधियों granulocytes 1-4 कैसे बदल दिया है यह मुश्किल सामूहिक रूप से पता लगाने के लिए कर रही है, अलग तरीकों का उपयोग कर phagocytosis क्षमता या ऑक्सीडेटिव फट पर जोर दिया। प्रवाह के क्षेत्र में अग्रिम cytometry के एक उच्च throughput ढंग 5 में कोशिकाओं की उच्च संकल्प, बहु रंग इमेजिंग में सक्षम benchtop उपकरणों के उत्पादन में हुई है। पारंपरिक प्रवाह के साथ इमेजिंग गठबंधन करने की क्षमता cytometry के तरीकों के cytometry के मौजूदा प्रवाह के भीतर नया और प्रतिरक्षा प्रणाली के बारे में नई जानकारी निकालने के लिए आवश्यक तकनीकी मंच प्रदान करता है कि एक उन्नति का प्रतिनिधित्व करता है।
पिछले दस वर्षों में, दूसरों के बीच में हमारी प्रयोगशाला, गौर से विभिन्न पोषण और व्यायाम उपचार patte के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया गयासहज प्रतिरक्षा समारोह 6-9 पर RNS। इस पांडुलिपि में प्रदर्शन विधि क्लीनिकल इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र के भीतर व्यावहारिक निहितार्थ हैं। वर्तमान पद्धति एक साथ जीवाणु कणों और ऑक्सीडेटिव फट के phagocytosis को मापने के लिए छवि आधारित फ्लो की शक्ति का लाभ उठाता है। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, एक विश्लेषण की छवि के आधार पर हिस्सा द्वारा प्रदान की चर का उपयोग कर सक्रिय granulocytes को अलग करने में सक्षम है। इन कैंपेन्स व्यक्ति granulocytes पर सेलुलर छवियों का आकलन करने के बाद ही पहचाना जा रहे थे। इसके अलावा परख ऊष्मायन समय तीन सक्रियण कैंपेन्स 10 के बीच संक्रमण को प्रभावित किया। इस प्रकार, यह कई ऊष्मायन बार के उपयोग के लिए एक विधि एक विशिष्ट प्रायोगिक इलाज के बाद granulocyte समारोह में परिवर्तन का परीक्षण करने की अनुमति दे सकता है कि प्रशंसनीय है। इस पांडुलिपि के प्रयोजन के लिए एक साथ oxidat साथ phagocytosis को मापने के लिए छवि आधारित फ्लो का उपयोग करके आकलन granulocyte समारोह की एक विधि प्रदर्शित करने के लिए किया गया थाIve फट।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान विधि 1,3,4,12-14 प्रवाह cytometry का उपयोग granulocyte समारोह के आकलन के लिए मौजूदा तरीकों की एक शोधन का प्रतिनिधित्व करता है। इस परख की महत्वपूर्ण कदम bioparticles और DHE के साथ खून का नमूना का उचित मिश्रण से संबंधित हो जाते हैं। अधूरा मिश्रण गलत परिणाम में परिणाम होगा। पूर्ण मिश्रण महत्वपूर्ण है, मिश्रण विधि प्रकृति में कोमल होना चाहिए। यह एक मिश्रण समारोह के बजाय एक भंवर मिक्सर के साथ एक इलेक्ट्रानिक pipet का उपयोग पूरा किया जा मिश्रण का सुझाव दिया है। परख में एक और महत्वपूर्ण कदम हमेशा परख नली के ऊपरी आधे contaminating कोई खून नहीं है सुनिश्चित करने के लिए है। इस अवशिष्ट रक्त एक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर हटाया जा सकता है। असफलता संयुक्त राष्ट्र के lysed लाल रक्त कोशिकाओं के साथ अंतिम परख तैयारी दूषित हो सकता है ऐसा करने के लिए, क्योंकि पूरी तरह हटाने के लिए महत्वपूर्ण है।
इस विधि उपयुक्त मुआवजा नियंत्रण का उपयोग करने से पहले सपा के लिए नियंत्रित करने के लिए जोड़ा जाना चाहिएgranulocyte समारोह के विभिन्न पहलुओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के बीच ectral ओवरलैप। इस विधि के लिए, मुआवजा नियंत्रण 40 मिनट परख ऊष्मायन सुझाव दिया और फिर एक एकल मार्कर के साथ लेबलिंग किया गया है कि रक्त के नमूनों को इकट्ठा शामिल है (यानी, ई कोलाई, DHE, आदि)। लेबलिंग के बाद, एक सकारात्मक घटनाओं एकत्र कर रहे हैं और एक मुआवजा मैट्रिक्स विचारों विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक स्वचालित विजार्ड उत्पन्न होता है। यह इस परख के लिए इस्तेमाल किया जाता है, तो उचित मुआवजा नियंत्रण उचित परख प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए पूरा कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है।
विश्लेषण उज्ज्वल विस्तार तीव्रता आबादी सबसे अलग चर रहा है कि पहचान के लिए और भी ज्यादा ओवरलैप ऑक्सीडेटिव फट और phagocytosis संकेतों के बीच मौजूद है कैसे पहचान करने के लिए सुविधा खोजक और सह स्थानीयकरण जादूगरों का उपयोग कर पूरा किया है। विशेष रूप से, छवि आधारित cytometry का उपयोग तीन कैंपेन्स में सक्रिय granulocytes अलग करने की क्षमता प्रदान की है। टीउसकी सबसेट टूटने ऑक्सीडेटिव फट बनाम phagocytosis की उज्ज्वल विस्तार तीव्रता का उपयोग कर निर्धारित किया गया था। इन विलक्षण सेल कार्यों की जांच करने के अलावा, एक ही संरचनात्मक स्थान (सह स्थानीयकरण) में एक ही समय में दोनों घटनाओं का प्रदर्शन किया है कि कोशिकाओं की पहचान की गई। "उच्च सक्रिय" सबसेट में गिर गई है कि granulocytes phagocytosis और oxidative फट के बीच लगातार सह स्थानीयकरण दिखा दिया कि केवल फेनोटाइप थे। सक्रिय granulocyte कैंपेन्स की इस पहचान को समस्या निवारण की जरूरत है, जहां सबसे बड़ा क्षेत्र है। एक नया उपयोगकर्ता विचारों में नमूना प्रक्रिया कार्यप्रवाह समझने के लिए समय लेने के लिए और इमेजिंग घटक का उपयोग सेल आबादी gating के यांत्रिकी समझने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है। एक उपयोगकर्ता बनाने के लिए प्राप्त कर सकते हैं कि अन्य संशोधनों के वैकल्पिक या अतिरिक्त परख ऊष्मायन बार के चयन में शामिल हैं। वर्तमान पद्धति 10-40 मिनट के durations के उपयोग से पता चलता है; हालांकि, प्रयोगात्मक मॉडल के आधार पर इस विधि है, जहांइस्तेमाल किया जाएगा, यह अब परख durations के चयन करने के लिए आवश्यक हो सकता है। इस तरह के एक संशोधन के एक व्यक्ति के आधार पर मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी।
इसके अलावा यह परख ऊष्मायन की अवधि तीन सक्रिय कैंपेन्स की उपस्थिति पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है कि निर्धारित किया गया था। इस रिपोर्ट में वर्णित दृष्टिकोण पहले से granulocyte समारोह 3,4,13,15 के संबंध में प्राप्त किया जा सकता है क्या जानकारी का एक विस्तार का प्रतिनिधित्व करता है। अन्य प्रयोगशालाओं उन्मुक्ति और रोग 15-17 के लिए एक व्यापक मूल्यांकन के भाग के रूप में granulocyte समारोह में परिवर्तन का आकलन करने के महत्व का प्रदर्शन किया है। इस परख की क्षमता होने के बावजूद यह सीमाओं के बिना नहीं है। प्रमुख सीमाओं में से एक उच्च throughput नमूना प्रसंस्करण से जुड़े लागत और समय की मांग है। एक अध्ययन के डिजाइन एक भी दिन में नमूने की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है, इन संसाधित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। प्रसंस्करण इलेक्ट्रॉनिक pipets और dispensers के उपयोग के द्वारा सुव्यवस्थित है,लेकिन इन महंगे होते हैं और हर प्रयोगशाला में जरूरी उपलब्ध नहीं हैं।
अनुसंधान के हमारे क्षेत्र व्यायाम और आहार की आदतों प्रतिरक्षा प्रणाली स्वास्थ्य को प्रभावित करने और 6,8-10,18-20 कैसे कार्य के एक अध्ययन पर केंद्रित है। इस तरह के उद्देश्यों से मानव स्वास्थ्य के क्षेत्रों की एक किस्म के लिए महत्वपूर्ण व्यावहारिक निहितार्थ हैं। Phagocytosis समारोह की निगरानी उपचार के परिणामों के लिए महत्वपूर्ण है, जहां व्यायाम और पोषण संबंधी प्रभाव के अध्ययन से परे इस पांडुलिपि में प्रदर्शन phagocytosis विधि क्लीनिकल इम्यूनोलॉजी के अन्य क्षेत्रों में उपयोगी हो सकता है। वर्तमान परख क्षमता के साथ प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के कोशिकामापी एक छवि आधारित प्रवाह से कर सकते हैं हो सकता है कि अद्वितीय इमेजिंग जानकारी के फायदे लेने के द्वारा फिर से आविष्कार किया है कि कई का पहला है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vacutainers | BD Life Sciences | used for blood collection | |
| WBC Fixative / RBC Lysis solution | eBioscience | 00-5333-57 | |
| CD66b-APC | eBioscience | clone G10F5 | |
| CD45-APCeFluor780 | eBioscience | clone 2D1 | |
| s.aureus bioparticles | Life Technologies | A10010 | |
| dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008 | |
| N-ethylmalemide | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| 7AAD | EMD Millipore | ||
| Hematology Analyzer | Mindray | BC-3200 | |
| 96-channel pipet | Integra Biosciences | ViaFlo | |
| Bead Bath Incubator | LabArmour | BeadBath | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | Amnis FlowSight | |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Amnis INSPIRE | |
| IDEAS Software | EMD Millipore | Amnis IDEAS | |
| X-Pierce Piercable Plate Sealer | Excel Scientific, Inc. | X-Pierce | |
| Dell Precision Workstation | Dell Computers | Various | Used for IDEAS analysis |
References
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