Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.
Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells’ (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.
En uunngåelig konsekvens av å bli gammel er den synkende evne til vev og organer for å være funksjonell. Adulte stamceller er avgjørende for å opprettholde vev homeostase og orgel funksjonalitet, men som organismer alder, stamcellene også oppleve en nedgang i sine biologiske oppførsel. Dette er spesielt skadelig for vev som har en høy omløpshastighet, slik som tarmepitelet. Kjennetegn på alderen stamceller inkluderer genomisk skade, svekket reparasjonsmekanismer, svekket cellesyklusregulering og misregulated signalveier, som alle påvirker normal stamcelle atferd (anmeldt i 1-3). Ved å manipulere spesifikke signalveier eller banke ned spesifikke gener, har vi fått innblikk i sine roller i å regulere og opprettholde normal stamcelle oppførsel. Siden de fleste av disse eksperimentene er kandidat molekyl tilnærminger, har vi svært lite kunnskap om de endogene molekylære endringer som skjer i stamceller underaldring. En måte å nærme seg dette spørsmålet er å sammenligne transkriptomet av unge versus gamle stamceller til å identifisere molekyler som uttrykk profilen endrer seg betraktelig under aldring. Dessverre har biologiske og tekniske utfordringer hemmet vår fremgang vedrørende denne tilnærmingen så langt.
Drosophila melanogaster er en svært passende modellorganisme for å studere aldring siden den har en kort levetid (ca. 60 til 70 dager), og oppviser aldring fenotyper (oversikt i 4). Videre kan aldringsprosessen i Drosophila akselereres ved temperatur. Ved å holde fluene ved 29 ° C, kan en alderen fenotype i tarmvevet allerede observeres etter 15 dager 5. Videre er Drosophila mottagelig for en mengde av genetiske manipulasjoner. Spesielt har Drosophila midgut stått som en utmerket modellsystem for å studere påvirkning av ulike signalveier og miljøutfordringer påbiologi tarm stamceller (ISCS) under aldring (anmeldt i 6-10). Drosophila tarmepitelet har en høy omløpshastighet og fornyes annenhver uke hos kvinner og en gang i måneden i menn 11. ISCS bosatt i Drosophila midgut har kapasitet til å dele seg og produsere en selv fornyet ISC og en post-mitotisk stamcelle kalt enteroblast (EB) 12,13. EB differensierer inn enten et absorberende enterocyte eller en sekretorisk enteroendocrine celle. Til denne datoen, er den eneste markøren kombinasjon som entydig etiketter en ISC uttrykk for transkripsjonsfaktoren escargot (ESG) og Notch ligand Delta (DL) 14. Men bare dette gjelder for en ung og sunn tarm. Under aldring, er midgut epitel preget av en økning i ISC spredning 15-17. I tillegg avvik Notch signale forstyrrer skjebnen avgjørelse av ISC dattercellerog induserer misdifferentiation av EBS 15. Dette resulterer i en akkumulering av celler som er aktive for Notch signalering og co-uttrykte ESG og Dl, og derved gjøre Dl ekspresjon utilstrekkelig til å identifisere bona fide stamceller i en alderen tarmen. Vanskeligheten med å identifisere ekte ISCS har hindret muligheten til å undersøke endogene endringer i aldring ISCS før nå.
Vi har taklet dette problemet ved å dra nytte av ESG -Gal4, UAS-GFP transgen fluesnøre da nivået av GFP uttrykk i ISCS og EBS er iboende forskjellige og forblir forskjellig gjennom aldring. En lignende metode er blitt beskrevet for isolering av larve neuroblasts og neuroner 18,19. Midguts av unge og gamle ESG -Gal4, UAS-GFP fluer ble dissekert og dissosiert i enkeltceller. Cellene ble deretter sortert for GFP-positive celler ved bruk av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Interessant, sortert GFP-positive calen fordelt i to tydelige topper basert på GFP fluorescens intensitet (GFP høy og GFP lav). Videre er fordelingen av de GFP-positive celler i de to toppene også korrelert med cellestørrelse: cellene som viste lav GFP intensitet var små og mindre kornet, mens celler med høy intensitet GFP var større og mer detaljert. Denne observasjonen foreslo at de mindre ISCS kunne skilles fra de større EBS hjelp FACS basert på GFP intensitet og velge passende frem scatter (FSC) og side scatter (SSC) innstillinger. Intrigere, forble de to toppene tydelig atskilt under aldring. Videre er forholdet mellom de to toppene forandret på en måte som reflekterer de nevnte kjennetegnene ved aldring midguts: nemlig at antall store, misdifferentiated EBS øker over tid. Fra disse funnene vi konkludere med at ved å sortere for GFP-positive celler ved hjelp av de aktuelle FACS parameterinnstillingene kan vi berike for ISCS og EBS når som helst punkt during aldring.
I sammendraget, introduserer vi en FACS strategi som gjør det mulig for forskere å berike for to ulike cellepopulasjoner, ISCS og EBS, fra Drosophila midguts i alle aldre og isolere disse cellene for videre analyse, som neste generasjons sekvensering. Denne kraftige metoden gjør det mulig for å studere de endogene molekylære mekanismer som er iboende til aldring i en beriket befolkning på stamceller eller stamceller. De oppnådde data fra disse studiene vil utvilsomt lette identifiseringen av konserverte molekyler som er vesentlig på tvers av arter i aldring.
Den presenterte protokollen beskriver en metode for å isolere ISCS fra unge og gamle voksne Drosophila midguts, som senere kan brukes til ytterligere molekylære analyser som neste generasjons sekvensering. FAC sortering av GFP-positive cellepopulasjon fra ESG -Gal4 har UAS-GFP fluesnøre allerede blitt oppnådd ved flere grupper 21,22. Men inntil nå tilstedeværelsen av de to tydelige topper av GFP-positive celler er enten oversett eller undervurdert. Vi viser at denne separasjon ikke bare representerer to forskjellige populasjoner av celletyper (ISCS og EBS), men også at de to toppene av GFP-positive celler bli tydelig atskilt under aldring. Denne observasjonen er svært relevant og verdifull for forskere som er interessert i å studere stamceller eller stamceller i løpet av aldring. Isolering av ISCS fra gamle midguts har vært hemmet av at det ikke er noen molekylær markør kombinasjon for å identifisere ISCS i en alderen tarmen. Den eneste markør som unambiguously identifiserer ISCS i en gammel midgut er fosfor-histone3 (PH3), siden ISCS er de bare dele celler i midgut 12,13. Imidlertid er PH3 en uegnet markør for å isolere ISCS fordi antall delende stamceller på ethvert gitt tidspunkt er for lav for å oppnå en grei mengde ISCS for etterfølgende analyser. Snøret ESG -Gal4, UAS-GFP er den vanligste fluesnøre som brukes av forskere som studerer ISC funksjon, vedlikehold og differensiering. Vår nåværende kunnskap om molekylær regulering av ISCS homeostase er basert på studier i hvilke spesifikke molekyler og signalveier er blitt manipulert (anmeldt i 7). Derfor har vi fortsatt mangler kunnskap om de endogene molekylære endringer som skjer i løpet av aldring. Den heri beskrevne fremgangsmåte lukker dette gap og er basert på det faktum at ISCS kan bli isolert basert på deres størrelse, granularitet og GFP intensitet fra voksne midguts som helst tidspunkt under aldring.
Mensetablere og optimalisere denne metoden vi har funnet følgende trinn for å være kritisk for en pålitelig resultat. Omtrent 200 guts må dissekert for å få en god mengde ISCS for FAC sortering. Hastigheten til disseksjon er avgjørende og avhenger av den enkelte praksis. En trenet person kan dissekere 40 guts innen 20-30 min. Siden GFP kommer også til uttrykk i de Malpighian tubuli i ESG -Gal4, UAS-GFP fluesnøre, er det viktig å fjerne de Malpighian tubuli fra midgut. De dissekerte midguts må holdes på et kjølig miljø for å unngå vev degradering og redusere RNAse aktivitet i vevet. Derfor må de dissekerte midguts overføres fra dissekere fatet i mikrosentrifugerør inneholdende kald 1 x PBS / 1% BSA-oppløsning etter at et maksimum på 20-30 min, og holdt på is. Imidlertid bør de dissekerte midguts ikke stå på is i mer enn 2 timer før du starter vev dissosiasjon med trypsin. Den mest efficient tilnærming er å dissekere så mange grupper av fluer som mulig innenfor disse 2 timer, deretter starte trypsin fordøye for disse partiene. Hvis flere midguts er nødvendig, kan de bli dissekert under inkuberingen tider av trypsin digest.
Selv trypsin er en meget potent enzym og kan ha skadelige effekter på celler, vi likevel fått nok levende, friske celler for påfølgende FAC sortering. Nøkkeltrinnet i vår fremgangsmåte som gjør det mulig for isolering av intakte celler er at de dissosierte cellene blir fjernet fra trypsinoppløsning hvert 30 min. Hvis de dissekerte midguts inkuberes i 2? T i en trypsin-inneholdende oppløsning ved romtemperatur, ble det observert en 20-30% økning i død, Sytox-positive celler. Det bør påpekes at trypsinoppløsning vi bruker inneholder EDTA. Tilstedeværelsen av EDTA letter sannsynligvis nedbrytning av vev chelatere kalsium- og magnesiumioner som er nødvendig for riktig funksjon av ekstracellulære matriks-molekyler. </p>
De mest avgjørende skritt for å lykkes slags ISCS fra unge og gamle guts er de riktige innledende innstillinger av FACS og port parametere med de beskrevne kontrollene og etter en bestemt sortering hierarki. Vi utførte FAC sortering på en ARIA II Flowcytometer (FACSDiva programvare). Det er viktig at apparatet er slått på minst en time før sortering for å varme opp lasere. Av notatet, når FAC sortering av ISCS blir fremført for første gang, parametrene for sortering og om erstatning må være satt opp ved hjelp av de nevnte kontrollene: (1) dissosiert celler fra villtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts uten tillegg av Sytox – sette denne parameteren (Trinn 4.4.1) hindrer sortering celler basert på deres autofluorescence; (2) dissosiert celler fra villtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts med Sytox lagt til – å sette denne parameteren(Trinn 4.4.2) kan skille død fra levende celler (døde celler har en høy autofluorescence og kan forurense sortert GFP-positive celler); (3) dissosiert celler fra midguts av ESG -Gal4, UAS-GFP fluesnøre uten Sytox – sikrer sette denne parameteren (trinn 4.4.3) at alle GFP-positive celler er plottet i spredningsdiagram. Hvis disse parametrene ikke er satt riktig, vil den sorterte cellepopulasjon mest sannsynlig inneholde døde celler og rusk (Figur 5B, C), mange GFP-positive celler vil bli savnet (Figur 5D) og de to tydelige topper for GFP-positive celler som sett i histogrammet tomten (Figur 2E og Figur 3E) vil ikke bli oppdaget. Når FACS og port parametere er satt, er instrumentet kalibrert og klar til å sortere celler fra ESG -GAL4, UAS-GFP fluesnøre. Siden disse parametrene kan lagres, all fremtid sortering økter for ISCS og EBS fra ESG -GAL4, UAS-GFP fluesnøre kan starte fra trinn 4.5. Selv om å velge den "renhet" modus, og å utføre en toveis renhet sorter reduserer antall celler sortert, gir det mulighet for en høyere sorteringsstringens (trinn 4.6 og figur 4B, C). Av notatet, fordelen med å bruke Sytox istedenfor propidiumjodid å merke døde celler er at det er bare en lav ringvirkninger inn i FITC (GFP) kanal, noe som gjør det enkelt å kompensere for smitte.
Vår fremgangsmåte for å anrike for ISCS og EBS, henholdsvis, er basert på sortering av cellene i henhold til forskjellige GFP ekspresjonsnivåer. Det kan være at under aldring av misdifferentiated EBS også uttrykke GFP på et lavere nivå, og kan forveksles som ISCS. Men siden sorterte cellene også variere i størrelse og detaljnivå, mener vi at vår sortering strategi er den mest egnet til denne datoen for å berike for ISCS og EBS. Dessuten er det kjent at cellene i et aldrings midgut feste ISC identitet har en liten kjerne 15. For å få mer klarhet om identiteten til de sorterte celler, kan man sortere celler fra en transgen fluesnøre som bærer ESG -GAL4, UAS-GFP og en Notch signale reporter transgenet. Siden Notch har vist seg å være aktiv bare i EBS 12,13, ISCS isolert fra en ung midgut ville være negativt for Notch reporter, mens EBS ville være positivt for Notch reporter. Men under aldring Notch signale blir avvikende i midgut vev. Derfor må det testes om denne eksperimentelle satt opp er faktisk mer pålitelig å skille mellom ISCS og EBS isolert fra en gammel midgut.
Vi har allerede ansatt denne tilnærmingen for komparativ transkriptom analyse av ISCS fra unge og gamle midguts og identifisert en rekke faktorer som er ulikt regulert under aldring (upub. Observ.). I tillegg gir denne metoden for å analysere forskjeller i genuttrykk mellom ISCS og EBS. Slike undersøkelsers vil gi innsikt i de første molekylære endringer som oppstår som en celle entrer differensiering prosessen. Dessuten vil isolering av EBS under aldring og påfølgende analyser belyse de molekylære endringer av alder-indusert misdifferentiation. Videre kan denne fremgangsmåte kan kombineres med andre genetiske verktøy som brukes i Drosophila å studere genfunksjon. Oppsummert denne metoden gir en objektiv tilnærming til å undersøke molekylære egenskaper og endringer av ISCS og EBS under aldring. Dette er et verdifullt verktøy som vil legge til rette for utforskning av aldringsmekanismer i voksen stilk og stamceller.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |