추가 분석을 위한 다양한 성분을 얻기 위해 전혈을 처리하는 방법론을 간략하게 설명합니다. 당사는 비임상 환경에서 전혈 샘플의 빠르고 높은 처리량의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 최적화했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
비 임상 설정에서 수집 및 전체 혈액 샘플의 처리와 기존 조건없이 모두 지역 사회에 거주하는 개인을 평가하는 독특한 기회를 제공합니다. 이들 샘플의 신속한 처리가 주요 세포 성분의 열화를 방지하는 것이 필수적이다. 동시에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), DNA에 대한 방법이 여기에 포함된다, RNA 및 처리와 대도시 지역에 걸쳐 참가자를 동의의 가정에서 수행 한 혈액 추첨에서 혈청 분리, 컬렉션의 2 시간 이내에 시작했다. 우리는 1,600 혈액 표본이어서 성공적인 DNA 메틸화, 유전자형, 유전자 발현에 이용하고 유동 세포 계측법 분석 한 항복 일관된 고품질의 재료를 처리하는 이러한 기술을 이용했다. 사용되는 방법 중 일부는 표준; 설명 된 방식으로 조합 그러나, 그들은 인구 문제 및 / 또는 참가자를 커뮤니티의 샘플의 효율적인 처리를 가능하게일반적으로 임상에서 평가되지 않는다 기반 연구. 따라서,이 프로토콜은 일반적인 인구의 대표적인 (후속 데이터) 샘플들을 획득 할 수있는 잠재력을 갖는다.
서론
여러 연구와 정신 (또는 다른) 1-4 질병없이 개인간 혈액 유전자 발현, DNA 메틸화 및 세포 서브셋의 차이를 특징으로하고있다. 이러한 연구는, 그러나, 질병 - 관련 차이 때문에 환자를 치료하고자하는 질병에 대해 일반적으로 더 심한 특성을 확대 할 수있는 임상에서 얻어졌다. 때문에 "오 믹스"접근 방법의 발전으로, 지난 십 질병 유병률의 인구 기반의 추정치를 제공하기 위해, 지역 사회 및 / 또는 역학적 설정 5-7에서 생물학적 샘플을 얻는에 대한 관심의 폭발과의 폭 넓은 사진을 보았다 이러한 정신적 / 육체적 질병의 환경 적 결정.
이에 대한 주요 과제는 수집 된 표본의 신속한 처리에 대한 요구이다. 단핵 세포, frequentl 아르 키 면역 시스템 구성 요소들의 열화Y는 개인의 건강, 수집 8-10의 2 시간 후 복구에 상당한 감소와 혈액 무승부를 즉시 시작 평가하는 데 사용됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 인간의 전체 혈액의 여러 구성 요소가 동시에 대도시 지역에 사는 주제의 가정에서 얻어진 샘플로부터 고립되는 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 우리의 컴파일 및 미래의 기술이 더 분리를 허용 이벤트에있는 모든 "추가"분수의 저장을 포함하여 현재 기술의....
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프로토콜
디트로이트 환경 건강 연구 검토와 미시간의 임상 시험 심사위원회의 대학에 의해 승인되었다. 모든 참가자는 이전 연구에 참여에 동의 정보를 제공했다.
1. 개요
- 제대로 엔드 포인트 데이터의 분석을 통해 모집에서 모든 단계를 문서화합니다. 단계 전환과 시간이 허락으로 중복, 동시에 1 일에 프로토콜을 수행합니다. 단계의 시퀀스는 성능 효율을 최적화하기 위해 기록된다. (1) 전체의 처리의 개요를도.
참고 : 용어 "참가자는"동의 개인으로부터 그린 드 확인 된 혈액 샘플을 나타 내기 위해 전반에 걸쳐 사용된다. 괄호 안의 시간은 아래의 실습 시간을 나타냅니다. 추적 시트 시험편 로그의 예는 각각 부가 테이블 S1과 S2에서 볼 수있다. 샘플은 가정에서 phlebotomists에 의해 수집(더 전처리 자세한 내용은 보충 정보 (SI 참조) 1) 택배로 연구 코디네이터에 의해 참가자를 동의 및 실험실로 운반로 식별 개인의.
2. 1 일 설치
- 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비합니다.
- 56 º....
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결과
이것은 전체적인 절차 유전자 마이크로 어레이와 RT-PCR 분석을 통해 발현 후성 변형을 검출하고, 셀 집합의 변화를 포함 하류 다수의 애플리케이션에서 분석을위한 높은 품질의 재료를 생성하는 것이 필수적이다. 표 1은 물질의 평균 수율 및 품질을 나타내는 각 프로세스에서. 3 백혈구 RNA 분리 및 필터 처리 방법의 품질의 출력의 예를 그림. 도 3의 좌측 이미지는 모세관 전기 영동에 의한 겔 사진이다. 각 레인은 저하를 나타냅니다 최소한의 그림자와 함께 두 가지 밴드를 생산한다. 아래 겔 크로마토 그램의 피크의 위치와 크기에 기초하여 결정될 수있다 열화의 레벨 및 유형에 추가적인 모습을 제공한다. (; 저하 낮음)에 RNA 무결성 번호 (린) 1 범위 다른 품질 측정10 (높은 순수한, 좋은 품질의 RNA).
이러한 높은 처리량 방법은 가끔 오류로 빌려 준다,하지만 품질 관리를 보장하.......
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토론
우리는 성공적으로 디트로이트 환경 건강 연구에 1,600 개 이상의 전체 혈액 샘플을 처리하기 위해 적용된 간소화 된 프로토콜을 설명했다. 이들 기술의 대부분은 기존 문헌에서 이용할 수 있지만, 각 단계 사이에 정확하게 타이밍 변화를 포함하여 단계별 편집, 성공적 하류 광범위한 응용으로 생물학적 시료의 종류를 생산 최적화 효율적인 프로토콜이 반영 DNA 메틸화, mRNA 발현과 면역 학적 분석을 포함. 이 시편은 이미 국가 회의 11,20,21,23,24,29에서 동료 검토 문헌에 출판 및 / 또는 제출 된 결과를있는 실험의 다양한 테스트되었습니다. 이 프로토콜은 따라서 DNHS 유사한 인구 기반 연구에서 생물 표본을 수집하고자하는 다른 연구자들의 관심을 끌 수있을 것입니다.
이러한 높은 throughp의 샘플을 처리 할 때UT 방식에서는, 모든 단계에서 정확한 기록을 유지하기 위해 매우 중요하다. 우리는 초기에 cryovial 모든 정보를 저장하는 데이터.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 세부 사항에 대한 귀중한 관심과 채혈 처리에 시간을 할애한 Henriette Mair-Meijers에게 감사드립니다. 나탈리 제임슨 키슬링(Natalie Jameson Kiesling)의 그래픽 디자인 전문 지식에 감사드립니다. 또한 여기에 언급된 제조업체(Qiagen(Valencia, CA), BD Biosciences(San Jose, CA), Life Technologies(Grand Island, NY))가 설명된 대로 제품 사용을 공개할 수 있도록 승인해 주셔서 감사합니다. 이 작업을 위한 자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 상 번호 DA022720, RC1MH088283 및 DA022720-05-S1에서 아낌없이 제공했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| QIAamp DNA 혈액 미니 키트 | Qiagen | 51104 | 1일차: DNA 분리 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma | P5493-1L | 1일차: PBMC 분리 |
| 5 ¾ ” 파스퇴르 피펫 | Fisher | 13-678-6A | 1일차: PBMC 분리 |
| 태아 소 혈청 (FBS), 열 비활성화 | Life Technologies | 10082147 | 1일차: PBMC 분리 |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | 1일차: PBMC 분리 |
| RPMI Medium 1640, 액체 | Invitrogen | 11875119 | 1일차: PBMC 격리 |
| 0.4% 트리판 블루 염색; | Invitrogen | T10282 | 1일차: PBMC 분리 |
| Countess 세포 계수 챔버 | Invitrogen | C10283 | 1일차: PBMC 분리 |
| Countess 자동 세포 계수기 또는 현미경 및 혈구계와 같은 세포 계수 장치 | Invitrogen | C10281 | 1일차: PBMC 분리 |
| LeukoLOCK 분획 및 안정화 키트 | Ambion | 1933 | 1일차: 백혈구 RNA 분리 |
| 25 G x 5/8 인치 바늘 | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA 분리 |
| 주사기 (5 ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | 2일차: 백혈구 RNA 분리 |
| 5 M NaCl | Life Technologies | 24740011 | 2일차: 백혈구 RNA 분리 |
| TRI 시약 | Ambion | 9738 | 2일차: 백혈구 RNA 분리 |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | 2일차: 백혈구 RNA 분리 |
| 스핀 카트리지 | Ambion | 10051G | 2일차: 백혈구 RNA 분리 |
| 0.1 mM EDTA | Ambion | 9912 | 2일차: 백혈구 RNA 분리 |
| DNA-free 키트 | Ambion | AM1960 | 2일차: DNase |
| treament RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: 바이오분석기 분석 |
| RNA 6000 Nano Series II 키트 | Agilent | 5067-1511 | 2일차: 바이오분석기 분석 |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | 2일차: 바이오분석기 분석 |
| 에탄올 >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| 이소프로판올 >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| 뉴클레아제가 없는 초순수 | Invitrogen | 9938 | |
| 피펫 팁(뉴클레아제 무함유) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter(혈청학) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| 피펫터(1 ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2 ml 및 5 ml cryovials 및 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브) | Fisher | 03-395-464 | |
| 시험관 랙 | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15 ml 폴리프로필렌 튜브 | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5 ml 및 0.65 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher | 07-200-534 및 07-200-185 | |
| 2 ml 및 5 ml cryovials | Fisher | 10-500-26 및 10-269-88F | |
| 8 ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 튜브 |
| 6 ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 튜브 |
| 8.5 ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 튜브 |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브용 가열 블록이 있는 건식 수조 인큐베이터 | Fisher | 11-715-1250 | |
| 세포 배양 후드 내에서 사용하기 위한 여과/진공 시스템 | Fisher | 01-257-87 | |
| 에어로졸 밀폐 뚜껑이 있는 마이크로 원심분리기 튜브용 고정각 로터 | Eppendorf | 22637002 | |
| 16 x 125 용 스윙 버킷 로터와 에어로졸 타이트 캡이 있는 냉장 원심분리기; mm vacutainers 및 15 ml 폴리프로필렌 튜브 | Eppendorf | 22628157 | 2, 냉장 할 필요가 없습니다 |
| Nanodrop 2000 (소량의 정확성을 위해 권장) 또는 기타 분광 광도계 장치 | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 액체 질소 탱크 | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| Sharps 용기 | Fisher | 22-037-970 | |
| 생물학적 폐기물 용기 | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 인증된 세포 배양 후드 | Thermo Scientific | 13-261-315 |
참고문헌
- Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
- Weigelt, K., et al.
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재인쇄 및 허가
