Elektroforetisk mobilitet (EMSA) for Studiet af RNA-protein interaktioner: Den IRE / IRP Eksempel
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at analysere RNA / protein-interaktioner. Den elektroforetiske mobilitet (EMSA) er baseret på forskellen migration af RNA / protein-komplekser og fri RNA under nativ gelelektroforese. Ved anvendelse af en radioaktivt mærket RNA-probe, kan RNA / protein komplekser visualiseret ved autoradiografi.
Abstract
RNA / protein-interaktioner er kritiske for post-transkriptionelle regulatoriske pathways. Blandt de bedst karakteriserede cytosoliske RNA-bindende proteiner er jern regulatoriske proteiner, IRP1 og IRP2. De binder til jern responsive elementer (IRES) i den utranslaterede regioner (UTR'er) af flere target mRNA'er, og styrer derved mRNA'erne oversættelse eller stabilitet. IRE / IRP interaktioner er ofte blevet studeret af EMSA. Her beskriver vi EMSA protokol for analyse IRE-bindende aktivitet af IRP1 og IRP2, som kan generaliseres til at vurdere aktiviteten af andre RNA-bindende proteiner samt. En råprotein lysat indeholdende et RNA-bindende protein eller et oprenset præparat af dette protein, inkuberes med et overskud af 32 P-mærket RNA-probe, der giver mulighed for kompleksdannelse. Heparin tilsættes til hinder non-specifikt protein til probebinding. Efterfølgende blandingen analyseret ved ikke-denaturerende elektroforese på en polyacrylamidgel. Den frie probevandrer hurtigt, mens RNA / proteinkompleks udstiller retarderede mobilitet; Derfor er fremgangsmåden også kaldet "gelretardering" eller "bandshift" assay. Efter afslutning af elektroforesen, gelen tørres og RNA / protein komplekser, såvel som fri probe, påvises ved autoradiografi. Det overordnede mål med protokollen er at påvise og bestemme IRE / IRP og andre RNA / protein-interaktioner. Desuden kan EMSA også anvendes til at bestemme specificitet, bindingsaffinitet og støkiometrien af RNA / protein-interaktion under undersøgelsen.
Introduction
EMSA blev oprindeligt udviklet til at studere sammenslutning af DNA-bindende proteiner med mål-DNA-sekvenser 1,2. Princippet er ens for RNA / protein-interaktioner 3, som er i fokus i denne artikel. Kort fortalt RNA negativt ladet og vil migrere mod anoden under ikke-denaturerende elektroforese i polyacrylamid (eller agarose) geler. Migration i gelen afhænger af størrelsen af RNA, som er proportional med dens ladning. Specifik binding af et protein til RNA ændrer sin mobilitet, og migrerer langsommere i forhold til den frie RNA. Dette skyldes primært en stigning i den molekylære masse, men også ændringer i ladning og eventuelt konformation. Ved hjælp af en mærket RNA som probe giver nem overvågning af "gelretardering" eller "bandshift". Anvendelse af 32P-mærkede RNA-prober er meget almindelig og giver høj følsomhed. Migrationen af RNA / protein komplekser og fri RNA detekteresved autoradiografi. Ulemper er den korte halveringstid på 32 P (14,29 dage), den gradvise forringelse af kvaliteten af sonden pga radiolyse, kravet om en radioaktivitet licens og infrastruktur til radioaktivitet arbejde, og potentielle biosikkerhed bekymringer. Derfor er der blevet udviklet alternative ikke-isotope metoder til mærkning af RNA-probe, for eksempel med fluorophorer eller biotin, som muliggør detektering af fluorescerende eller kemiluminescerende billeddannelse 4,5. Begrænsninger ved disse metoder er de højere omkostninger og ofte nedsat følsomhed i forhold til isotopisk mærkning, og potentialet af ikke-isotopiske mærker til at interferere med interaktionen RNA / protein. Ikke-denaturerende polyacrylamidgeler er egnet til de fleste EMSA anvendelser og er almindeligt anvendt. Til tider kan agarosegeler udgøre et alternativ til analyse af store komplekser.
Den største fordel ved EMSA er, at det kombinerer enkelhed, følsomhed og robusthed 4 </ Sup>. Assayet kan være afsluttet inden for et par timer og kræver ikke sofistikeret instrumentering. RNA / protein-interaktioner kan detekteres ved EMSA i koncentrationer så lave som 0,1 nM eller mindre, og inden for en bred vifte af bindende betingelser (pH 4,0-9,5, monovalent saltkoncentration 1-300 mM, og temperatur 0-60 ° C).
RNA / protein-kompleks kan også undersøgt af filter-bindingsanalyse. Dette er en enkel, hurtig og billig procedure er baseret på tilbageholdelse af RNA / protein-komplekser i et nitrocellulosefilter, medens en fri RNA-probe passerer gennem 6. Sammenlignet med EMSA, er det begrænset i tilfælde, hvor RNA-probe indeholder flere bindingssteder, eller den rå ekstrakt indeholder mere end et RNA-bindende proteiner, der binder til proben på samme sted. Mens flere RNA / protein-interaktioner vil undslippe opdagelse af filteret-bindingsassay, kan de let visualiseres ved EMSA. I nogle tilfælde, visualisering er even mulig, når to RNA / protein-komplekser co-migrere (for eksempel human IRP1 / IRE og IRP2 / IRE komplekser) ved tilsætning af et antistof mod et af de RNA-bindende proteiner til EMSA reaktionen, hvilket gav yderligere forsinkelse på gelen ( "supershift") 7.
EMSA er blevet bredt anvendt til at undersøge IRP1 og IRP2, som er post-transkriptionelle regulatorer af jern metabolisme 8-10. De fungerer ved at binde til IRES, fylogenetisk konserverede hårnålestrukturer inden UTR'er i flere mRNA'er 11. IRES blev først opdaget i mRNA'erne kodende ferritin 12 og transferrin receptor 1 (TfR1) 13, proteiner af jern lagring og optagelse hhv. Senere blev IRES fundet i erythroid-specifik aminolevulinatsynthaseaktivitet (ALAS2) 14 mitochondrial aconitase 15 ferroportin 16 divalent metal transportør 1 (DMT1) 17, hypoxi inducerbar faktor 2 <em> α (HIF2α) 18, og andre mRNA'er 19-21. Prototypen H- og L-ferritin mRNA'er indeholde et IRE i deres 5'-UTR, mens TfR1 mRNA indeholder flere IRES i sin 3'-UTR. IRE / IRP interaktioner specifikt hæmmer ferritin mRNA oversættelse sterisk blokere dens forening af 43S ribosomale subunit; Desuden har de stabiliserer TfR1 mRNA mod spaltning i kernen. IRP1 og IRP2 andel omfattende sekvens lighed og udviser høj IRE-bindende aktivitet i jern-udsultede celler. I jern-fyldt celler, IRP1 samler en cuban Fe-S klynge, der konverterer det til cytosol aconitase på bekostning af sin IRE-bindende aktivitet, mens IRP2 gennemgår proteasomalaktivitet nedbrydning. Således IRE / IRP interaktioner afhænger af cellulære jernstatus, men er også reguleret af andre signaler, såsom H 2 O 2, nitrogenoxid (NO) eller hypoxi. Her beskriver vi protokollen til vurdering IRE-bindende aktivitet fra rå celler og væv ekstrakter af EMSA. Vi anvendte et 32P-mærket H-ferritin IRE probe, der blev genereret ved in vitro transkription fra et plasmid DNA skabelon (I-12.CAT), hvor IRE sekvens oprindeligt blev indført i sense-orientering nedstrøms for T7 RNA polymerase sted ved kloning af annealede syntetiske oligonukleotider 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri beskriver vi en protokol, der er udviklet til at studere IRE-bindende aktiviteter IRP1 og IRP2, og vi viser repræsentative data. Ved hjælp af forskellige prober, kan denne protokol også justeres til undersøgelse af andre RNA-bindende proteiner. Et kritisk trin er størrelsen af proben. Anvendelse af lange prober, der er fælles, når det nøjagtige bindingssted er ukendt, kan resultere i RNA / protein-komplekser, som ikke migrerer anderledes end det frie RNA. I dette tilfælde er det tilrådeligt at fjern…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
References
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
- Rio, D. C. . Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).
- Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
- Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
- Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
- Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
- Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
- Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
- Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
- Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
- McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
- Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
- Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
- Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3′-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
- Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
- Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
- Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
- Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
- Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
- Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
- Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
- Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
- Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
- Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
- Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).
