Elektrofore Mobility Shift Assay (EMSA) for studier av RNA-Protein Interaksjoner: The IRE / IRP Eksempel
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å analysere RNA / protein interaksjoner. Den elektroforetiske mobilitet skift analyse (EMSA) er basert på differensial migrering av RNA / protein-komplekser og fri RNA under opprinnelig gelelektroforese. Ved å bruke en radioaktivt merket RNA-probe, kan RNA / proteinkomplekser bli visualisert ved autoradiografi.
Abstract
RNA / protein interaksjoner er kritiske for post-transkripsjonsregulerende trasé. Blant de best karakterisert cytosoliske RNA-bindende proteiner er jern regulatoriske proteiner, IRP1 og IRP2. De bindes til jern responsive elementer (IRES) innenfor de ikke-translaterte regioner (UTR) av flere mål-mRNA, for derved å styre mRNA oversettelse eller stabilitet. IRE / IRP interaksjoner har blitt mye studert av EMSA. Her beskriver vi EMSA-protokollen for å analysere IRE-bindende aktivitet av IRP1 og IRP2, som kan generaliseres for å vurdere aktiviteten av andre RNA-bindende proteiner i tillegg. En rå protein lysat som inneholder en RNA-bindende protein, eller et renset preparat av dette protein, blir inkubert med et overskudd av 32 P-merket RNA-probe, slik at for kompleksdannelse. Heparin ble tilsatt for å forhindre ikke-spesifikk protein til probe binding. Deretter blir blandingen analysert ved ikke-denaturerende elektroforese på en polyakrylamid-gel. Den frie sondevandrer raskt, mens RNA / protein komplekse utstillinger tilbakestående mobilitet; Derfor er fremgangsmåten også kalt "gel retardasjon" eller "bandshift" assay. Etter fullføring av elektroforese, gelen ble tørket og RNA / proteinkomplekser, så vel som fri probe, blir detektert ved autoradiografi. Det overordnede målet med protokollen er å oppdage og kvantifisere IRE / IRP og andre RNA / protein interaksjoner. Videre kan EMSA også brukes for å bestemme spesifisiteten, bindingsaffinitet, og støkiometri av RNA / protein interaksjon under undersøkelse.
Introduction
EMSA ble opprinnelig utviklet for å studere sammenslutning av DNA-bindende proteiner med target DNA-sekvenser 1,2. Prinsippet er det samme for RNA / protein interaksjoner tre, som er i fokus i denne artikkelen. I korthet, blir RNA negativt ladet og vil migrere mot anoden under ikke-denaturerende elektroforese på polyakrylamid (eller agarose) geler. Migrering innenfor gelen avhenger av størrelsen av RNA, som er proporsjonal med dens kostnader. Spesifikk binding av et protein til RNA forandrer sin bevegelsesfrihet, og den komplekse vandrer langsommere i forhold til den frie RNA. Dette skyldes i hovedsak en økning i molekylvekt, men også til endringer i kostnad og muligens konformasjon. Utnytte en merket RNA som probe gir enkel overvåking av "gelretardasjon" eller "bandshift". Bruk av 32 P-merket RNA prober er svært vanlig, og tilbyr høy følsomhet. Migrasjon av RNA / protein komplekser og gratis RNA oppdagesved autoradiografi. Ulempene er de korte halveringstid på 32 P (14,29 dager), den gradvise forringelse av kvaliteten av sonden på grunn av radio, kravet om et radioaktiviteten lisens og infrastruktur for radioaktivitet arbeid, og for biologisk potensielle bekymringer. Derfor har alternative ikke-isotoper metoder for merking av RNA probe blitt utviklet, for eksempel med fluoroforene eller biotin, som gjør påvisning av fluorescerende eller kjemiluminiscerende bildebehandling 4,5. Begrensninger av disse fremgangsmåter er de høyere kostnader og er ofte redusert sensitivitet sammenlignet med isotopisk merking, og potensialet av ikke-isotop-markører for å interferere med RNA / protein-interaksjon. Ikke-denaturering polyakrylamidgeler er egnet for de fleste EMSA applikasjoner og blir ofte brukt. Av og til kan agarosegel utgjøre et alternativ for analyse av store komplekser.
Den store fordelen med EMSA er at den kombinerer enkelhet, følsomhet og robusthet 4 </ Sup>. Analysen kan være ferdig i løpet av noen timer, og krever ikke avansert instrumentering. RNA / protein interaksjoner kan påvises ved EMSA ved konsentrasjoner så lave som 0,1 nM eller mindre, og innenfor et bredt spekter av bindingsbetingelser (pH 4,0 til 9,5, monovalente saltkonsentrasjon 1-300 mM, og temperatur 0-60 ° C).
RNA / protein-kompleksdannelse kan også bli studert av filterbindingsanalysen. Dette er en enkel, rask og rimelig prosedyre basert på oppbevaring av RNA / protein komplekser i et nitrocellulosefilter, mens en gratis RNA probe går gjennom seks. Sammenlignet med EMSA, er den begrenset i de tilfeller hvor RNA probe inneholder flere bindingsseter, eller det rå ekstrakt inneholder mer enn en RNA-bindende proteiner som bindes til proben på samme sted. Mens flere RNA / protein interaksjoner vil unnslippe deteksjon av filterbindingsanalysen, kan de lett bli visualisert ved EMSA. I noen tilfeller, er visualisering even er mulig når to RNA / proteinkomplekser samvandrer (for eksempel human IRP1 / IRE og IRP2 / IRE komplekser), ved tilsetning av et antistoff mot en av RNA-bindende proteiner til EMSA reaksjonen, noe som ga ytterligere retardasjon på gelen ( "supershift") 7.
EMSA har vært mye brukt til å studere IRP1 og IRP2, som er post-transcriptional regulatorer av jern metabolisme 8-10. De opererer ved å binde seg til Ires, fylogenetisk konserverte hårnål strukturer innenfor UTR av flere mRNA 11. IRES ble først oppdaget i mRNA som koder for ferritin 12 og transferrin reseptor 1 (TfR1) 13, proteiner av jern lagring og opptak, respektivt. Senere Ires ble funnet i erythroid spesifikke aminolevulinat syntase (ALAS2) 14, mitokondrie aconitasen 15, Ferroportin 16, toverdig metal transporter 1 (DMT1) 17, hypoksi induserbar faktor 2 <em> α (HIF2α) 18, og andre mRNAer 19-21. Prototypen H- og L-ferritin mRNAs inneholde en IRE i sin 5 'UTR, mens TfR1 mRNA inneholder flere Ires i sin 3' UTR. IRE / IRP interaksjoner spesifikt hemme ferritin mRNA oversettelse av sterisk blokkere sin tilknytning av 43s ribosomale subenheten; dessuten stabilisere de TfR1 mRNA mot endonucleolytic cleavage. IRP1 og IRP2 aksje omfattende sekvenslikhet og viser høy IRE-bindende aktivitet i jern-sultet celler. I jern fylt celler, samler IRP1 en cubane Fe-S klynge som konverterer det til cytosolisk aconitasen på bekostning av sin IRE-bindende aktivitet, mens IRP2 gjennomgår proteasomal degradering. Således IRE / IRP interaksjoner avhenge av den cellulære jernstatus, men er også regulert av andre signaler, som for eksempel H 2 O 2, nitrogenoksid (NO) eller hypoksi. Her beskriver vi protokollen for å vurdere IRE-bindingsaktivitet fra rått celler og vev ekstrakter av EMSA. Vi brukte en 32 P-merkede H-ferritin IRE probe som ble generert ved in vitro transkripsjon fra en plasmid DNA-templat (I-12.CAT), hvor IRE-sekvensen ble opprinnelig innført i sense-orientering nedstrøms for T7-RNA-polymerase-område ved kloning av glødet syntetiske oligonukleotider 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri beskriver vi en protokoll som er utviklet for å studere IRE-bindende aktiviteter av IRP1 og IRP2, og vi viser representative data. Ved å bruke forskjellige prober, kan denne protokollen også justeres for studiet av andre RNA-bindende proteiner. Et kritisk punkt er størrelsen av proben. Bruk av lange prober, noe som er vanlig når det nøyaktige bindingssetet er ukjent, kan resultere i RNA / protein-komplekser som ikke migrerer annerledes enn den frie RNA. I dette tilfelle er det tilrådelig å fjerne ubundet RN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
References
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
- Rio, D. C. . Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).
- Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
- Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
- Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
- Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
- Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
- Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
- Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
- Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
- McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
- Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
- Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
- Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3′-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
- Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
- Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
- Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
- Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
- Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
- Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
- Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
- Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
- Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
- Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
- Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).
