Oncolytic वायरस के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए अध्ययन में कपास चूहा की हैंडलिंग
Summary
Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.
Abstract
Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.
Introduction
Oncolytic वायरस (OV) चुनिंदा सामान्य और ट्यूमर कोशिकाओं 1,2 के बीच जैव रासायनिक मतभेद शोषण से ट्यूमर कोशिकाओं में पेश करता है। के रूप में स्वाभाविक रूप से जंगली प्रकार के वायरस के लिए भेजा चयनात्मक oncolysis प्राप्त करने के लिए एक परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है कि उन लोगों के लिए, और चयनात्मक oncolysis को प्राप्त करने के लिए इंजीनियर किया जाना चाहिए जो उन: OVS के दो प्रकार के होते हैं। एक दिया ट्यूमर के प्रकार के भीतर म्यूटेशन का संग्रह एक OV 2 के लिए सामान्य कोशिकाओं से अधिक चयनात्मक विकास लाभ की प्रकृति को निर्धारित करता है। का उपयोग कर OVS की सुरक्षा और लाभ क्लिनिकल परीक्षण 3-7 में प्रदर्शन किया गया है। Oncolytic virotherapy के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद बेहतर मॉडल OVS की अर्बुदरोधी प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने की जरूरत है, सुझाव है कि पूर्व नैदानिक और नैदानिक परिणामों के बीच अंतराल वहाँ मौजूद हैं।
गोजातीय दाद वायरस टाइप 1 (BHV-1) एक Herpesviridae परिवार के सदस्य है, और Alphaherpesviridae उपपरिवार है। BHV-एक initiates एक बुरा ठंड 8,9 जैसी लक्षणों की एक विस्तृत विविधता में प्रकट, पशुओं में सांस की बीमारी जटिल गोजातीय। BHV-एक ऐसे heparan सल्फेट और nectin-1 के रूप में 10 एचएसवी -1 द्वारा इस्तेमाल के लिए लगाव और प्रवेश रिसेप्टर्स, बांधता है। हालांकि, यह nectin-2 10 के स्थान पर CD155 बांधता है। BHV-1 यह कुशलता से प्रवेश करने और सामान्य और तब्दील murine कोशिकाओं 3,4,10 में प्रतिकृति आरंभ करने में असमर्थ है कि इस तरह के एक बहुत ही संकीर्ण मेजबान रेंज है। इस पारंपरिक murine मॉडल का उपयोग समस्याग्रस्त बनाता है। BHV-1 के oncolytic क्षमता विट्रो 11,12 में प्रदर्शन किया गया है। BHV-एक स्तन कैंसर की कोशिकाओं और स्तन कैंसर की शुरुआत कोशिकाओं 11,12 सहित ऊतकीय मूल की एक किस्म से मानव ट्यूमर कोशिकाओं में प्रतिकृति शुरू करने और मारने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, BHV-1 के अर्बुदरोधी क्षमता एक असुरक्षित मेजबान के संदर्भ में vivo में मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
मानव Adenovirus (विज्ञापन), जिसके लिए57 की पहचान की सीरमप्रकारों सबसे आम तौर पर मनुष्यों में सांस की बीमारी का कारण बनता है, वहाँ रहे हैं। Oncolytic विज्ञापन वैक्टर कई क्लिनिकल परीक्षण 13-15 में आगे बढ़ने के साथ उनके अर्बुदरोधी प्रभावकारिता के लिए मूल्यांकन किया गया है। होनहार पूर्व नैदानिक डेटा के बावजूद, नैदानिक परिणाम उम्मीदों से कम गिर गया है। वे वायरस 16,17 करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया तनु एक्ज़िबिट हालांकि मानव ट्यूमर xenograft मॉडल आम तौर पर, विज्ञापन वैक्टर अर्बुदरोधी प्रभावकारिता अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके अलावा, syngeneic murine मॉडल, विज्ञापन संक्रमण के लिए गैर-अनुमोदक हैं 17,18 अव्यावहारिक इन मॉडलों का उपयोग करते हुए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यांकन कर रही है।
मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली OVS ट्यूमर कोशिका मृत्यु 19 बटोर जिसके द्वारा सबसे प्रभावशाली तंत्र के रूप में पहचान की गई है। Tolerized और गैर tolerized ट्यूमर जुड़े प्रतिजन के बीच अर्बुदरोधी प्रतिक्रियाओं (TAA) मॉडल भिन्न होते हैं और बहुत OV चिकित्सा की सफलता को प्रभावित कर सकते हैं। एचएसवी -1 OV KM100 (ICP0 n21220) 20,21 1814 में VP16 एक murine Polyoma मध्य टी प्रतिजन स्तन कैंसर मॉडल 22 में ट्यूमर असर चूहों के 80% में ट्यूमर प्रतिगमन हासिल। हालांकि, उसके-2 / Neu मॉडल में, KM100 की अर्बुदरोधी प्रभावकारिता ट्रांसजेनिक में syngeneic चूहों में 20% पूरा प्रतिगमन और ट्यूमर ठहराव के बीच विभिन्न चूहों HER2-tolerized। एक साथ इन डेटा पूरी तरह से सबसे अच्छा पूरी तरह से चिकित्सीय सफलता का निर्धारण क्या विशेषताएं समझने के लिए मानव प्रतिरक्षा परिदृश्य पुनरावृत्ति कि पशु मॉडल का उपयोग कर OVS के मूल्यांकन के महत्व पर प्रकाश डाला।
(5 में समीक्षा के रूप में) उत्तर और दक्षिण अमेरिका के लिए स्वदेशी कपास चूहा (Sigmodon hispidus), सबसे अधिक श्वसन syncytial वायरस के संक्रमण की एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है। वे 6,23 जटिल गोजातीय सांस की बीमारी के साथ जुड़े विकृति पुनरावृत्ति के रूप में कपास चूहों भी विरोधी BHV -1 टीकाकरण अनुसंधान में इस्तेमाल कर रहे हैं। कपास चूहों के अलावा, BHV -1 संक्रमण, immunogenic है निरंतर श्लैष्मिक और प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 6,23-25 उत्प्रेरण। सेल लाइनों सहज fibrosarcoma और स्तन ग्रंथि (LCRT) और हड्डी (सीसीआरटी और VCRT) क्रमश: 26 की osteosarcomas से प्राप्त किया गया है। कपास चूहों वे विज्ञापन संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं के रूप में oncolytic विज्ञापन वैक्टर के vivo प्रभावकारिता का मूल्यांकन और मनुष्यों 27-29 के समान विकृति प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। OVS के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए प्रतिरक्षा अक्षमता मॉडल के उपयोग से न केवल उपचार के लिए नैदानिक प्रतिक्रियाओं की कम संकेत कर रहे हैं, लेकिन वे oncolytic virotherapy 30,31 में खाते में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका को ले पाते। इसलिए, syngeneic और स्तन कार्सिनोमा और ऑस्टियो सार्कोमा के ट्यूमर tolerized कपास चूहे मॉडल पारंपरिक murine मॉडल का उपयोग कर अध्ययन नहीं किया जा सकता है, जो इस तरह के BHV-1 के रूप में OVS, और विज्ञापन के पूर्व नैदानिक प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में जो प्रासंगिक मॉडल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Breanne Cuddington holds a fellowship from the Canadian Breast Cancer Foundation. This work was sponsored by operating grants from the Cancer Research Society and the Canadian Cancer Society Research Institute (formerly the Canadian Breast Cancer Research Alliance). We thank Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) for LCRT cells and Dr. Kathleen Delaney and Marion Corrick for technical assistance with cotton rat housing and sedation.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965-092 | May use any brand |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Can prepare in lab, filter to sterilize | ||
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | May use any brand |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | May use any brand |
| Fetal bovine serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| T-150cm2 tissue culture flask | Fisher Scientific | 14-826-80 | May use any brand |
| 1X TypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| 12-well cell culture plate, flat bottom | Fisher Scientific | 08-772-29 | May use any brand, must be tissue culture treated |
| alamarBlue | Life Technologies | DAL1025 | May use an alternative reagent for determination of cell viability |
| 8640 Teklad 22/5 Rodent diet | Harlan | 8640 | |
| 1/8” corncob rodent bedding | Harlan | 7092 | |
| Nestlets | Ancare | – | Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable |
| 50 mL Conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | May use any brand, must be sterile |
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| 70% Ethanol | Can prepare in lab | ||
| 10 % Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | May use any brand |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments/Description |
| NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) | NAPCO | Model used not currently available | May use any brand |
| Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath | Fisher Scientific | Model used not currently available | May use any brand |
| Reichert Bright-line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | May use any brand |
| Typhoon Trio BioAnalyzer | GE Healthcare Life Sciences | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader | Tecan | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Allegra 6R benchtop centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| Table Top Anaesthesia machine | VetEquip | Model used not currently available | May use any brand, must be portable |
| Wahl Peanut Mini Clippers | Wahl | May use any brand of small clippers | |
| Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL | BD | 329464 | May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. |
| Cotton swabs | MedPro | 018-425 | May use any brand |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
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