We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Candida albicans développement de biofilm sur des surfaces biotiques et / ou abiotiques représente une menace spécifique pour les patients hospitalisés. Jusqu'à présent, C. biofilms albicans ont été étudiés principalement in vitro, mais il ya un besoin crucial pour une meilleure compréhension de ce processus dynamique dans des conditions in vivo. Nous avons développé un modèle de rat sous-cutanée in vivo pour étudier C. albicans formation de biofilm. Dans notre modèle, multiple (jusqu'à 9) appareils infectés par Candida sont implantés à la partie arrière de l'animal. Cela nous donne un avantage majeur sur le système de modèle de cathéter veineux central car il nous permet d'étudier plusieurs biofilms indépendants dans un animal. Récemment, nous avons adapté ce modèle pour étudier C. le développement de biofilm albicans chez la souris BALB / c. Dans ce modèle, mûrir C. biofilms albicans développent dans les 48 heures et démontrent l'architecture du biofilm tridimensionnelle typique. La quantification de biofilm fongiqueest traditionnellement analysé post-mortem et exige le sacrifice d'accueil. Parce que cela nécessite l'utilisation de nombreux animaux pour réaliser des études cinétiques, nous avons appliqué la bioluminescence imagerie non invasive (BLI) de suivre longitudinalement dans vivo mûrir C. albicans biofilms développer dans notre modèle sous-cutanée. C. albicans cellules ont été modifiées pour exprimer le gène de la luciférase de Gaussia princeps (Gluc) fixée à la paroi cellulaire. Le signal de bioluminescence est produite par la luciférase qui convertit la coelentérazine de substrat ajouté à la lumière qui peut être mesurée. Le signal BLI ressemblait nombre de cellules obtenues à partir de cathéters explantées. Imagerie non invasive pour quantifier la formation de biofilm in vivo fournit des applications immédiates pour le dépistage et la validation de médicaments antifongiques dans des conditions in vivo, ainsi que pour les études basées sur les interactions hôte-pathogène et contribuant à une meilleure compréhensiontion de la pathogenèse des infections liées aux cathéters.
Candida albicans est un organisme commensal, qui se trouve à différents sites d'individus en bonne santé, par exemple sur la peau ou en tant que partie de la flore vaginale et gastro-intestinal. Cependant, dans hospitalisé, et surtout les patients immunodéprimés, il peut provoquer un large éventail d'infections 1. Chez ces individus, le système immunitaire est affaibli permet aux cellules de Candida pour diffuser dans la circulation sanguine et envahissent les tissus profonds provoquant des infections potentiellement mortelles. En outre, la présence de substrats abiotiques tels que des cathéters veineux centraux et des voies urinaires, des soupapes et des joints cardiaques artificielles peut fournir un créneau pour Candida accessoire 2. Adhérence à ces substrats est un préalable à la poursuite du développement du biofilm, ce qui représente une couche de cellules de levure et hyphes enrobé dans un matériau polymère extracellulaire, constitué principalement de deux polysaccharides. C. albicans cathéter associée au gène infectionssont associés à des taux de mortalité élevé. Une caractéristique générale de biofilms est leur sensibilité diminuée aux antifongiques connus, tels que les azoles 3,4. Seulement nouvelles classes de médicaments antifongiques tels que échinocandines et formulation liposomale d'amphotéricine B se sont révélées actives contre les infections liées aux cathéters 5-7. En raison de biofilm résilience aux antifongiques, les approches thérapeutiques sont très limitées, conduisant souvent à l'enlèvement du cathéter et son remplacement ultérieur comme une solution unique.
La plupart de notre compréhension actuelle de C. le développement de biofilm albicans provient des études in vitro sur des substrats abiotiques tels que le polystyrène, ou des matières plastiques utilisées pour la fabrication des dispositifs mentionnés ci-dessus, ce est à dire, silicone, polyuréthane 2. Ces modèles sont très avancés et essaient d'imiter le plus fidèlement la situation in vivo que possible. Toutefois, ces systèmes ne comportent pas l'écoulement sanguin continu et til système immunitaire de l'hôte. Il en a résulté le développement de systèmes de modèle in vivo, tels que le modèle cathéter veineux central (CVC) 8-10, le modèle de prothèse dentaire de la stomatite candidose buccale 11 et un modèle murin pour cathéter associé candidurie 12. En outre, C. le développement de biofilm albicans a été étudiée in vivo sur les surfaces des muqueuses, telles que celles de la cavité vaginale 13 et 14 par voie orale. Notre laboratoire a contribué à la création d'un sous-cutanée C. modèle de biofilm albicans, qui est basé sur l'implant de morceaux de cathéters infectés sur le dos de rats Sprague-Dawley 15. Ce modèle a été utilisé avec succès dans notre laboratoire pour tester la sensibilité au fluconazole biofilm et échinocandine médicaments 5,16, pour étudier l'effet de la thérapie combinatoire de diclofénac et caspofungine 17. Plus récemment, nous avons adapté ce système pour une utilisation dans souris BALB / c 18,19. Encomparaison avec d'autres modèles in vivo, le principal avantage de ce modèle sous-cutanée est la possibilité d'étudier plusieurs biofilms par animal développé à l'intérieur du lumen de cathéter de pièces implantées.
Pour réduire le nombre d'animaux de laboratoire, nous avons adapté ce modèle pour étudier le développement de C. albicans biofilms non invasive en utilisant l'imagerie par bioluminescence (BLI) 18,19. Cette méthode se est avérée une technique puissante, qui peut être utilisée pour quantifier les biofilms en mesurant le signal spécifique BLI à la région d'intérêt (dans notre cas, la zone de cathéters implantés), évitant le sacrifice animal. Par rapport à des bactéries, qui peut exprimer à la fois le gène et le substrat nécessaire à la réaction de bioluminescence en raison de l'introduction d'un opéron lux 20 spécifique, la plupart des organismes eucaryotes, y compris C. albicans, dépendent de l'expression hétérologue d'un gène de la luciférase couplée à laadministration externe d'un substrat spécifique, telle que D-luciférine ou 21 coelentérazine. Probablement en raison de la présence de la paroi cellulaire fongique et C. albicans morphogenèse, la délivrance intracellulaire du substrat pour l'enzyme luciférase a été un défi principal 21. Afin de résoudre ce problème, Enjalbert et al. 22 conçu une souche où C. synthétique albicans version optimisée codon du gène de la luciférase de Gaussia princeps naturellement sécrétée (Gluc) a été fusionné à l'C. PGA59 gène albicans, une ancre GPI protéine de la paroi cellulaire. En raison de la présence de la luciférase à la paroi cellulaire, des problèmes concernant la disponibilité intracellulaire du substrat pourraient être évités. Ce système particulier a été utilisé pour étudier les infections superficielles provoquées par C. 22 albicans. Très récemment, BLI a également été utilisé pour suivre la progression de la candidose oropharyngée et son possibltraitement de l'e 23. Ces résultats appuient l'utilisation de BLI comme une technique prometteuse pour étudier les infections causées par des cellules vivant en liberté, mais aussi les infections associées aux périphériques.
Dans cette étude, nous décrivons la C. albicans développement d'un biofilm sur des morceaux de cathéters de polyuréthanne dans des souris BALB / c et sa quantification à l'aide de BLI. Nous fournissons un protocole détaillé de la colonisation in vitro de cathéters de polyuréthanne au cours de la période d'adhérence suivie de l'implantation chez la souris et le développement de biofilm subséquente d'animaux vivants. Outre la mesure du signal émis par le BLI C. cellules albicans, on détermine également la unités formant des colonies pour la comparaison avec la technique classique de biofilm fongique charge quantification.
L'utilisation de modèles animaux, et en particulier les modèles rongeurs, pour les études réservés aux biofilms microbiens est très important que le système immunitaire de l'hôte est un facteur essentiel dans la formation de biofilm que les modèles in vitro ne peuvent pas expliquer. Dans cette étude, nous décrivons un sous-cutanée C. relativement simple biofilm modèle de la souris albicans, qui peut être facilement adopté dans un laboratoire de recherche et ne nécessite…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
Agar granulated | Difco | 214530 | |
D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
Equipment | |||
Cell counting chamber | |||
Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
Electric razor | For small animals | ||
Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
Heating pad | Leica | 14042321474 | |
Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |