말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성
Summary
This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.
Abstract
The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.
Introduction
T 림프구는 적응 면역 시스템의 중요한 구성 요소입니다. T 세포뿐만 아니라 직접 효과기 메카니즘을 통해 다양한 병원균에 보호 면역 반응을 매개 할뿐만 아니라 적극적으로 자기 면역 관용을 유지하고 면역 체계에서 다른 세포의 반응을 지시 할 책임이있다. 이러한 함수는 T 세포 수용체 (TCR) 결찰, 사이토 카인 및 케모카인, 및 대사 산물 일 포함한 집적 신호의 숫자를 통해 지향된다. 이 적응 면역으로 T 세포의 역할을 정의하는 특성 특이성을 제공하기 때문에 이러한 신호 중, TCR은 특히 중요하다. TCR은 T 세포의 이펙터 기능을 시작하는 신호를 제공하기 위해 민감도와 특이도가 매우 높은 방식으로 MHC (인간의 ortholog의 HLA) 분자 (pMHC 단지)에 의해 제시 선형 펩티드 항원과 상호 작용한다. pMHC 리간드와 TCR 상호 작용의 생화학 매개 변수 T에 대한 특이성뿐만 아니라 제공세포 활성화는 또한 후속하는 T 세포의 기능 (2)에 정 성적 영향을 미친다. 따라서 공부 T 세포의 기능은 종종 정의 항원 특이성 T 세포 클론의 응답을 검사하는 요구한다.
10 8 별개 αβTCRs 3-4 – 약 10 12 αβ의 T 세포를 함유하는 인간 T 세포 구획, 추정 된 107를 포함한다. 이 다양한 레퍼토리 보호 면역에 대한 T 세포 반응을 필요로 할 가능성이 병원균에서 펩타이드의 광대 한 배열의 인식을위한 기회를 제공한다. 그 항원 5 종래 면역 반응의 부재 10-7 – 이는 자기 MHC 제시 주어진 외래 항원에 대한 T 세포 응답의 주파수는 10-4 정도이다 것으로 추정된다. 나이브 T 세포 레퍼토리는 펩티드 항원 및 한계 반응 제시 자기 MHC 인식하는 능력을 보장하기 위해 흉선 선택에 의해 형성된다자기 항원에 대한 펩타이드의 ivity 보호 면역성이 중개 용 잠재 성을 극대화. 이 위반 반응성, 비교적 큰 주파수, 10-3 설계에서 그러나, – 면역 나이브 개체로부터 T 세포 10-4을, 외국인 MHC 분자뿐만 아니라 그들이 제시 내인성 펩티드를 모두 인식 동종 세포 자극에 반응 6. 동종 pMHC 리간드의 인식은 자기 MHC 제시 외국 항원의 인식과 구조적으로 유사하다; TCR은 동종 MHC 분자뿐만 아니라 펩티드 제시 7 모두 중요한 생화학 적 상호 작용을한다. pMHC의 다양성으로부터 동종 자극의 결과로 T 세포 반응의 강력한 특성상 동종 세포 (8)의 표면에 존재하는 복합체. 이것은 각각의 MHC 약 2 × 4 다른 내인성 펩티드 항원 제시 9 것으로 추정된다. 이 B동종 자극에 대한 응답의 readth은 T 세포 alloreactivity 인한, 이러한 숙주 질환 (GVHD) 대 동종 이식 거부 반응 또는 이식편과 같은 임상 적으로 관련 병리학의 중요한 측면이다.
인간 T 세포 alloreactive 반응 연구는 전통적으로 동종 세포 자극 이후 나이브 T 세포의 클론 반응 검사에 의존하고있다. 한계 희석 조합 같은 동종 세포주 반복 자극은 동종의 HLA (10)의 정의와 인식 클론 T 세포를 생성 할 수있다 분석한다. 내인성 pMHC의 크고 다양한 HLA 레퍼토리는 T 세포의 광범위한 레퍼토리를 자극 주어진 동종위한 본 복합체 그러나,이 접근법은, 개별 pMHC 동종 리간드에 대한 반응을 검사하는 문제가있다. 이 벌크 인구 자극 제한 희석 방법은 원하는를 Reacti와 T 세포를 분리하기 위해 다수의 클론의 스크리닝을 필요하나의 pMHC 리간드에 대한 vity. 또한, 개별 pMHC 동종 리간드에 반응 T 세포의 빈도는 소정의 항원에 응답하여 인간 T 세포 클론의 효율적인 생성에 대한 장벽을 제공 나이브 T 세포 집단 중에서 비교적 낮다.
식별 및 클론 집단에서 항원 특이 적 T 세포의 분리는 형광 표지 된 pMHC의 다량 체 (11)의 현상에 의해 활성화되었습니다. 이 접근 방법은 스트렙 타비 딘 – 표지 된 형광 물질에 결합함으로써 표시되어 재조합 가용성 바이오틴 MHC 분자에로드 특정 펩타이드 항원을 이용한다. pMHC의 Multimerization 수용성 pMHC 리간드 TCR의 본질적 낮은 (μM)의 친 화성을 보상 결합력을 증가시킨다. 표지 된 세포를 식별하고 유동 세포 계측법에 의해 단리 할 수있다. 그러나,이 접근은 아직 일반적이다 나이브 T 세포 집단 중 항원 특이 적 T 세포의 낮은 주파수에 의해 제한된다대부분의 유동 세포 계측기에 대한 정확한 확인 및 정량 한계 이하의 크기 순서. 이러한 한계를 해결하기 위해, 테트라 – 표지 된 세포 pMHC 량체 라벨 및 후속 자성 비드 농축 방법 (12)을 개발되었다. 이 방법은 신뢰할 수있는 검출, 열거 및 저주파수 항원 특이 적 T 세포의 분리를 보여 주었다.
이 프로토콜은 특별히 개별 pMHC 동종 리간드에 반응 인간 T 세포 클론의 생성을위한 유효 프로토콜을 설명한다. 프로토콜은 단일 정렬 세포로부터 T 세포 클론의 생산 (활성화 세포 분류 유세포 인간 T 세포의 생체 외 배양을위한 견고한 방법 alloantigen 특정 인간 T 세포의 분리를 위해 합체 라벨링 및 농축 pMHC (HLA)을 적용 그림 1의 개요).
Protocol
Representative Results
Discussion
T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100 x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
References
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