Cet article propose une méthode pour étudier la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome, à l’aide d’une construction synaptobrevin2-pHluorin et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. La stratégie développée pour le traitement d’images et l’analyse des données est également rapportée.
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Article de méthode
TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l'évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les vésicules synaptiques libèrent des neurotransmetteurs au niveau des synapses chimiques à travers un cycle dynamique de la fusion et la récupération. Suivi de l'activité synaptique en temps réel et disséquer les différentes étapes de exo-endocytose au niveau d'une seule vésicule sont cruciales pour comprendre les fonctions synaptiques dans la santé et la maladie.
Génétiquement codés sondes sensibles au pH visant directement les vésicules synaptiques et réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) fournissent la résolution spatio-temporelle nécessaire de suivre la dynamique de vésicules. Le champ évanescent généré par réflexion interne totale ne peut exciter des fluorophores placés dans une couche mince (<150 nm) au-dessus du couvercle de verre sur lequel les cellules adhèrent, exactement là où les processus de exo-endocytose ont lieu. Les images à contraste élevé qui en résultent sont parfaitement adaptés pour des vésicules suivi et l'analyse quantitative des événements de fusion.
Dans ce protocole, SH-SY5Y n humainecellules euroblastoma sont proposées comme un modèle précieux pour étudier la libération de neurotransmetteurs au niveau d'une seule vésicule par TIRFM, en raison de leur surface plane et la présence de vésicules dispersées. Les méthodes pour la culture de SH-SY5Y comme cellules adhérentes et pour leur transfection avec synapto-pHluorin sont fournis, ainsi que la technique pour effectuer l'imagerie et TIRFM. Enfin, une stratégie visant à sélectionner, compter et analyser les événements de fusion au niveau des cellules entières et unique vésicules est présenté.
Pour valider la procédure d'imagerie et l'analyse des données approche, la dynamique de vésicules pHluorin-marqués sont analysés en vertu de repos et stimulés (dépolarisants concentrations de potassium) conditions. Dépolarisation membranaire augmente la fréquence des événements de fusion et provoque une augmentation parallèle du signal de fluorescence nette enregistrée dans la cellule ensemble. Analyse d'un seul vésicules révèle modifications de comportement fusion-événement (hauteur accrue de pointe et la largeur). Ces données suggèrent eà la dépolarisation de potassium non seulement induit une libération de neurotransmetteurs massive, mais modifie également le mécanisme de la fusion des vésicules et le recyclage.
Avec la sonde fluorescente approprié, cette technique peut être utilisée dans différents systèmes cellulaires pour disséquer les mécanismes de sécrétion constitutive et stimulée.
Introduction
La transmission synaptique chimique entre les neurones est un mécanisme majeur de la communication dans le système nerveux. Elle se appuie sur la libération de neurotransmetteurs par un cycle dynamique de la fusion des vésicules et la récupération sur le site présynaptique. Un grand nombre de protéines impliquées dans la dynamique des vésicules ont été identifiés; Toutefois, leur contribution spécifique au phénomène reste à préciser une.
Notre compréhension est en partie limitée par le fait que les tests les plus largement utilisés pour exo / endocytose ne sont pas toujours les plus appropriées. Plusieurs études relatives à la ....
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Protocole
1. Culture cellulaire et transfection
- Culture de cellules SH-SY5Y
REMARQUE: Les expériences ont été effectuées en utilisant le neuroblastome humain SH SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y grandir comme un mélange de grappes flottantes et les cellules adhérentes. Suivez les instructions figurant dans le protocole (de densité cellulaire, rapport de division, etc.) D'avoir des cellules qui se développent fermement attachés à couvercle en verre, qui est crucial pour TIRFM.- Avant de commencer, sous le poste de sécurité microbiologique à flux laminaire, de porter le volume opportun de solution de phosphate s....
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Résultats
Les procédures de la FRBR imagerie et analyse des données décrites sont conçus pour étudier la dynamique des vésicules dans les systèmes cellulaires. Cette technique peut être utilisée pour déterminer les effets de molécules de signalisation et des médicaments sur les événements de fusion et de la dynamique des vésicules 17 neurotransmetteur. Utilisation de protéines de membrane de plasma GFP étiqueté, l'analyse de la TIRFM a été utilisée pour caractériser le trafic constitutive de transporteurs de glutam.......
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Discussion
Cet article présente un protocole à l'image et à analyser la dynamique des vésicules dans les cellules sécrétant, utilisant des vecteurs et TIRFM ADNc codé fluorescentes. Les éléments clés de l'imagerie par TIRFM succès sont la sélection du modèle cellulaire et transfection de cellules avec des indicateurs optiques génétiquement codés de la libération des vésicules et le recyclage.
TIRFM est idéal pour la croissance des cellules adhérentes à un couvercle de verre plat et suffisamment.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier l'Università degli Studi di Milano pour le soutien aux Eliana Di Cairano (post-doctorat) et Stefania Moretti (Ph.D. bourse). Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche de l'Université PUR CP
Nous tenons à remercier le professeur Jeremy M. Henley, École de biochimie, Université de Bristol, Royaume-Uni, pour la pHluorin construire et le Dr Francesco Dotti d'assistance dans l'analyse de données, et Silvia Marsicano pour l'assistance technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Équipement | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss | 491912-9850-000 | microscope inversé |
| Laser Argon multiligne Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | laser à ions argon multiligne (458/488/514 nm), 100 mW |
| Lame TIRF laser | Zeiss | 423681-9901-000 | |
| Objectif 100X | Zeiss | 421190-9900-000 | à immersion, NA 1,45 Alpha-Plan |
| Caméra CCD RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | ||
| Changement optique de filtres LAMBDA 10-3 avec SmartShutter | Sutter Instrument Company | ||
| Logiciels | |||
| Logiciel Image ProPlus 6.3 | Media Cybernetics | sélection de points, sélection de régions d’intérêt (ROI), détermination de l’intensité de fluorescence | |
| Excel | Microsoft | correction du photoblanchiment, analyses au niveau de la cellule entière et des vésicules individuelles | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | analyse statistique |
Références
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W.
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Réimpressions et autorisations
