В этой статье представлен метод исследования динамики везикул нейротрансмиттеров в клетках нейробластомы с использованием конструкции синаптобревин2-pHluorin и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Также сообщается о разработанной стратегии обработки изображений и анализа данных.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
TIRFM и рН-чувствительные GFP-зонды для оценки нейромедиатора пузырька динамики в SH-SY5Y клеток нейробластомы: Сотовый изображений и анализ данных
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Synaptic пузырьки выпустить нейротрансмиттеров на химических синапсов с помощью динамического цикла синтеза и поиска. Мониторинг синаптической активности в режиме реального времени и рассечения различные этапы экзо-эндоцитоза на уровне одного пузырька имеют решающее значение для понимания синаптические функции в норме и патологии.
Генетически кодируется рН-чувствительных датчиков, непосредственно направленные на синаптических пузырьков и полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM) обеспечивают пространственно-временным разрешением необходимую для отслеживания динамики пузырьков. Мимолетны поле, создаваемое полного внутреннего отражения может только возбудить флуорофоров, размещенные в тонком слое (<150 нм) выше стеклянной крышкой, на которой клетки придерживаться именно там, где имеют место процессы экзо-эндоцитоза. В результате высокая контрастность изображения идеально подходит для пузырьков отслеживания и количественного анализа событий слияния.
В этом протоколе, SH-SY5Y человек пeuroblastoma клетки предлагаются в качестве полезной моделью для изучения высвобождение нейромедиаторов на уровне одного пузырька по TIRFM, из-за их плоской поверхности и в присутствии дисперсных пузырьков. Способы выращивания SH-SY5Y как адгезивные клетки, а также для трансфекции их synapto-pHluorin предоставляются, а также методики для выполнения TIRFM и визуализации. Наконец, стратегия стремится выбрать, рассчитывать и анализировать события в стиле фьюжн в уровнях цельноклеточных и одного пузырька представлены.
Для проверки метода анализа процедуры визуализации и передачи данных, динамика pHluorin-меченых везикул анализироваться в рамках отдыха и стимулировали (деполяризующими концентрации калия) условия. Деполяризацию мембраны увеличивает частоту событий слитых и вызывает параллельное повышение чистого сигнала флуоресценции, записанной в целой клетки. Анализ Single-пузырек показывает изменения поведения Fusion-событий (увеличение максимальной высоты и ширины). Эти данные свидетельствуют о йв деполяризации калия не только вызывает массовое освобождение нейромедиатора, но также изменяет механизм слияния пузырьков и утилизации отходов.
При соответствующей флуоресцентного зонда, эта техника может быть использована в различных клеточных системах рассекать механизмы конститутивной и стимулированную секрецию.
Введение
Химический синаптической передачи между нейронами является основным механизмом связи в нервной системе. Он опирается на высвобождение нейротрансмиттеров через динамический цикл слияния пузырьков и поиска в пресинаптической сайте. Многие из белков, участвующих в динамике везикулы были определены; Однако, их удельный вклад в феномен еще предстоит уточнить 1.
Наше понимание отчасти ограничена тем, что наиболее широко используемые тесты на экзо / эндоцитоза не всегда являются наиболее подходящим. Несколько исследований, связанных с слияния пузырьков и динамика полагаться на электрофизиологических методов. Эта техника обеспечивает о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культивирование и трансфекция клеток
- Культура клеток SH-SY5Y
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводились с использованием нейробластомы человека SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266)15. Клетки SH-SY5Y растут как смесь плавающих кластеров и адгезивных клеток. Следуйте инструкциям, указанным в протоколе (плотность клеток, коэффициент расщепления и т. д.), чтобы клетки, которые растут, прочно прикреплялись к стеклянной крышке, что имеет решающее значение для TIRFM.- Перед началом работы, под ламинарным проточным шкафом биобезопасности, вносят своевременный объем стерильного фосфатного буферного солевого раствора (ПБС) и п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанные процедуры TIRF-визуализации и анализа данных предназначены для изучения динамики везикул в клеточных системах. Этот метод может быть использован для определения влияния сигнальных молекул и лекарственных препаратов на процессы слияния и динамику нейромедиаторных везикул17. С использованием белков плазматической мембраны с GFP-меткой анализ методом TIRFM применялся для характеристики конститутивного транспорта GFP-меченных транспортеров глутамата в глиальных и эпителиальных клетках18,19.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данной работе представлен протокол визуализации и анализа динамики везикул в секретирующих клетках с использованием флуоресцентных кДНК-кодируемых векторов и TIRFM. Ключевыми элементами успешной визуализации с помощью TIRFM являются выбор клеточной модели и трансфекция клеток с генетически закодированными оптическими индикаторами высвобождения и переработки везикул.
TIRFM идеально подходит для выращивания клеток, прилегающих к стеклянной крышке и достаточно плоских, чтобы обеспечить стабильн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность Università degli Studi di Milano за поддержку Элиане Ди Кайрано (стипендия постдокторантуры) и Стефании Моретти (стипендия доктора философии). Эта работа была поддержана университетской исследовательской программой PUR to C.P.
Мы хотели бы поблагодарить профессора Джереми М. Хенли, Школа биохимии, Бристольский университет, Великобритания, за конструкцию pHluorin, а также доктора Дотти Франческо за помощь в анализе данных, а также Сильвию Марсикано за техническую помощь.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Оборудование | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss | 491912-9850-000 | инвертированный микроскоп |
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | многолинейный (458/488/514 nm), 100 mW аргоновый ионный лазер |
| Laser TIRF slider | Zeiss | 423681-9901-000 | |
| Объектив 100X | Zeiss | 421190-9900-000 | Иммерсионный, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD-камера RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | ||
| Оптический переключатель фильтров LAMBDA 10-3 с SmartShutter | Sutter Instrument Company | ||
| Программное обеспечение | |||
| ПО Image ProPlus 6.3 | Media Cybernetics | выбор точек, выбор ROI, определение интенсивности флуоресценции | |
| Excel | Microsoft | коррекция фотовыгорания, анализ всей клетки и отдельных везикул | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | статистический анализ |
Ссылки
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
