Glutamat och Hypoxi som stress modell för isolerade perfusion Ryggradsdjur Retina
Summary
Med denna studie, vi införa en standardiserad stressmodell för isolerade superfuseras nötkreatur näthinnan för framtida preklinisk terapeutisk testning. Effekten av antingen hypoxi (ren N 2) eller glutamat stress (250 iM glutamat) på retinafunktionen representeras av a- och b-vågsamplituder utvärderades.
Abstract
Neuroprotektion har varit en stark område som ska undersökas i oftalmologisk forskning under de senaste decennierna och påverkar sjukdomar som glaukom, retinal vaskulär ocklusion, näthinneavlossning och diabetesretinopati. Det var föremål för denna studie för att införa en standardiserad stressmodell för framtida preklinisk terapeutisk testning.
Bovina näthinnor bereddes och perfuserades med en syremättad standardlösning, och ERG registrerades. Efter inspelningen stabila b-vågor, hypoxi (ren N 2) eller glutamat stress (250 um glutamat) utövades i 45 min. För att undersöka effekterna på fotoreceptor funktion ensam, var 1 mM aspartat sattes för att erhålla a-vågor. ERG-återhämtning övervakades under 75 min.
För hypoxi, observerades en minskning i en-vågsamplitud av 87,0% noterades (p <0,01) efter en exponeringstid av 45 min (minskning med 36,5% efter utgången av washout p = 0,03). Dessutom, en initial Decrlätthet i b-vågsamplituder av 87,23% noterades, som nådde statistisk signifikans (p <0,01, minskning med 25,5% vid slutet av washout, p = 0,03).
För 250 um glutamat, en initial 7,8% reduktion av en-vågsamplituder (p> 0,05), följt av en minskning med 1,9% (p> 0,05). En minskning på 83,7% av B-vågsamplituder (p <0,01) noterades; Efter en washout på 75 minuter var minskningen 2,3% (p = 0,62). I denna studie är en standardiserad stressmodell presenteras som kan vara användbar för att identifiera möjliga nervskyddande effekter i framtiden.
Introduction
Neuroprotektion har varit en stark område som ska undersökas i oftalmologisk forskning under de senaste decennierna. Näthinnan är en mycket känslig neuronala nätverket som beror signifikant på syresättning och påverkas starkt av metabolismen av dess omgivande celler. Större okulära patologier relaterade till nervcellskador är retinala vaskulära ocklusioner, glaukom och näthinneavlossning.
Retinal artär ocklusion, som ett exempel för retinal vaskulär ocklusion, leder till en plötslig förlust av synen genom hypoxi av inner näthinnan 1. Det förknippas ofta med allmänna vaskulära sjukdomar 2 och leder till en ihållande synnedsättning 1, med endast 8% av patienterna återhämtar synskärpa avsevärt 1. Även arteriell fibrinolys har föreslagits som ett behandlingsalternativ, kunde förmånen inte visas i en randomiserad klinisk prövning 3.
Glaukom och näthinneavlossningbåda har en ökning av glutamatkoncentration 4-6. Glutamat under fysiologiska betingelser påträffas som en excitatorisk sändare genom hela centrala nervsystemet och det inre näthinnan 7,8. Förhöjda glutamatnivåer har hittat inte bara i glaukom och näthinneavlossning 5,6 men också i proliferativ diabetesretinopati 9. En ökning av glutamat leder möjligen till excitotoxicitet och, därför, nervcellskada 10. I de flesta fall av näthinneavlossning och i vissa fall av proliferativ diabetesretinopati kirurgi på näthinnan (pars plana vitrektomi) är nödvändiga. Under pars plana vitrektomi mekanisk manipulation, starkt ljus av optisk fiber eller skjuvspänning utövas av höga flöden av bevattningslösningar under långa operationer utövar en ytterligare påfrestning på näthinnan 11,12.
Alla de nämnda sjukdomarna har det gemensamt att patologin är lokaliserad till Retinen ensam och ställa oftalmologiska gemenskap med utmaningen att hitta sätt att skydda näthinnan som en neuro systemet.
Elektroretinogram (ERG) är standardmetoden för utvärdering av in vivo-fotoreceptor funktion (a-våg) och funktionen av den inre näthinnan (b-våg). ERG mäts med silverelektroder som införs i hornhinnan och ögonen stimuleras av en ökande grad av ljus för att upptäcka defekter i stavar eller koner eller i inner näthinnan. Olika defekter i näthinnan kan detekteras genom förändringar i amplituden (styrkan av svar) eller latensen (tiden-till-respons-intervall) av ERG. Olika ERG protokoll och mätmetoder (mönster ERG, multifokal-ERG eller ljusa fält ERG) tillåter ytterligare differentiering av defekter. Tekniken för den isolerade näthinnan har införts nyligen, vilket gör det möjligt att utvärdera effekter på näthinnan utan störningar från t.ex. en studie djuretsallmänna reaktioner 13,14.
Det var syftet med denna studie för att utvärdera och införa en definierad och standardiserad stressmodell för hypoxi och glutamat stress på superfuseras isolerade näthinnan. Således hoppas vi att lägga grunden för framtida studier av nervskyddande effekter av vissa ämnen eller intraokulära bevattningslösningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie var en betydande inverkan på b-vågsamplitud efter 45 min av hypoxi hittas. Denna minskning var fortfarande signifikant efter wash-out fasen. En liknande effekt på fotoreceptorn potentialen kunde observeras.
Resultaten stöds av andra publicerade data 16 och ger oss möjlighet att studera eventuella nervskyddande effekter efter hypoxi.
Efter 45 min utläggning av 250 | iM glutamat, vi finna en statistiskt signifikant påverkan endast p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This paper is dedicated to my beloved wife Maren and our little Karl.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Germany | 1,064,041,000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Germany | 1,050,010,250 | |
| 0.1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Germany | 58,330,250 | |
| 0.15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Germany | 111 TA106282 | |
| 1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Germany | 1,065,860,500 | |
| 5 mM glucose | Merck Pharma, Germany | 40,741,000 |
References
- Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
- Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. Hypertension-related eye disorders). Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).
- Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
- Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
- Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
- Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
- Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
- Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
- Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
- Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
- Schultheiss, M., et al. Dulbecco’s Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
- Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
- Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
- Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
- Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
- Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
- Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
- Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).
