Beredning av ett transmembranprotein, den spänningskänsliga jonkanaler, KvAP, in Giant enlamellvesiklar för mikroskopi och Patch Clamp Studies
Summary
Den beredning av transmembranproteinet, KvAP, till gigantiska enlamellvesiklar (GUVs) demonstreras för två uttorkning-rehydrering metoder – electroformation och gel-assisterad svullnad. I båda metoderna, är små unilamellära vesiklar innehållande proteinet smält samman för att bilda GUVs som sedan kan studeras genom fluorescensmikroskopi och patch-clamp-elektrofysiologi.
Abstract
Giant enlamellvesiklar (GUVs) är ett populärt biomimetisk system för att studera membran tillhörande fenomen. Emellertid, som vanligen används protokoll för att odla GUVs måste modifieras för att bilda GUVs innehållande funktionella transmembranproteiner. I artikeln beskrivs två uttorkning-rehydrering metoder – electroformation och gel-assisterad svullnad – att bilda GUVs innehåller spänningsstyrda kaliumkanalen, KvAP. I båda metoderna, är en lösning av protein-innehållande små unilamellära vesiklar delvis dehydratiseras för att bilda en stapel av membran, som sedan får svälla i en rehydrering buffert. För electroformation metoden är filmen deponeras på platinaelektroder så att en AC fält kan appliceras under film rehydrering. I motsats härtill använder gelén assisterade svullnad metod en agarosgel substrat för att förbättra film rehydrering. Båda metoderna kan producera GUVs i låga (t.ex. 5 mM) och fysiologiska (t.ex. 100 mm) saltkoncentrationer. De resulte GUVs karakteriseras via fluorescensmikroskopi, och funktionen av rekonstituerade kanaler mäts med insidan ut patch-clamp konfiguration. Medan svallning i närvaro av ett alternerande elektriskt fält (electroformation) ger ett högt utbyte av defektfria GUVs, producerar gelén assisterade svullnad metod en mer homogen proteinfördelning och kräver ingen speciell utrustning.
Introduction
När man studerar de fysikaliska principer som styr levande system, underifrånperspektiv tillåta en experimentalist att styra systemet sammansättning och andra parametrar som inte är lätt manipuleras i cellbaserade system 1. För membranbaserade processer, har Giant enlamellvesiklar (GUVs, diameter ~ 1-100 nm) visat sig vara en mycket användbar biomimetisk systemet 2-7 eftersom de är väl lämpade för mikroskopi studier och mikromanipulation 8-10. Det finns många olika protokoll för att producera GUVs, de flesta delas in i två kategorier – emulsion baserad närmar 11,12 och tekniker som bygger på återfukt en lipidfilm 13-16. I emulsionsbaserade metoder, är de inre och yttre broschyrer av de guv membran sammansatta sekventiellt från lipidmonolager vid gränsytor vatten / olja. Detta tillvägagångssätt är idealisk för inkapsling lösliga proteiner medi GUVs, och för att bilda GUVs med asymmetrisk bipacksedel lipidkomposition. Däremot kan GUVs bildade från emulsioner behålla spår av lösningsmedel som ändrar membran mekaniska egenskaper 17, och tillvägagångssättet är inte särskilt väl lämpad för transmembranprotein beredning.
Film rehydrering metoder bygger på det faktum att torka (uttorkning) orsakar många lipidblandningar att bilda en fler lamellär trave membran. Om denna stapel placeras sedan i kontakt med en vattenhaltig buffert, kommer membranen i stapeln rör sig från varandra som lösningsmedelsflöden mellan dem och vid ytan av stapeln, kan individuella membraner lösgöra att bilda GUVs 13,18 (liksom en veritabel zoo andra lipidiska föremål). Men även för optimala buffert och lipidkompositioner har denna klassiska "spontan svullnad" metoden en relativt låg avkastning på felfria GUVs. En allmänt använd metod för att öka utbytet av felfria GUVs är "electroformation221 ;, i vilken en växelström (AC) fält anbringas under film rehydrering. Medan mekanismen förblir förstås dåligt, "electroformation" kan ge spektakulära guv avkastning (> 90% under gynnsamma omständigheter) för låg saltkoncentration buffertar (<5 mM) 14,19, och kan även arbeta i fysiologiska buffertar (~ 100 mM) använder en högre frekvens (500 Hz kontra 10 Hz) växelfält och platinaelektroder 15. Ett alternativt tillvägagångssätt för att öka utbytet av felfria GUVs är "gel assisterad svullnad", där lipidlösningen deponeras på ett polymersubstrat gel snarare än passiva (t.ex. glas, PTFE) substrat som används i klassisk "spontan svullnad ". När den resulterande lipid / gel film uppblött, kan GUVs snabbt bilda även för fysiologiska buffertar 16,20.
Alla dessa metoder kan producera lipid-enbart GUVs som kan användas för att studera membranassocierade fenomen såsom deninteraktion mellan lösliga proteiner och membran. Men för att inkorporera ett transmembranprotein i GUVs, är betydande ändringar som behövs för att säkerställa att proteinet förblir i ett funktionellt tillstånd under hela rekonstitueringsproceduren. Medan lösningar av lipider i organiska lösningsmedel (t.ex. kloroform, cyklohexan) är idealiska för att framställa lipidfilmer, trans-membranproteiner är typiskt endast stabila när deras hydrofoba transmembrandomänen är inbäddad i ett lipiddubbelskikt, eller omges av en detergent-micell ( t.ex., under proteinrening). Sålunda är utgångsmaterialet för en rekonstituering typiskt nativa membran, renat protein i en rengöringslösning, eller små unilamellära proteininnehållande vesiklar (Proteo-SUVs) och / eller multilamellära vesiklar (Proteo-MLVs) bildade genom avlägsnande diskmedel i närvaro av lipider. De flesta metoder för att införliva dessa membranproteiner i GUVs faller i tre kategorier.
Direkt Insertion: Transmembranprotein upphängd i diskmedel blandas med förformade, lipid-only, milt tvättmedel lösta GUVs och rengöringsmedel avlägsnas sedan använda biobeads 21. Medan konceptuellt enkel, kräver denna metod exakt kontroll av detergentkoncentrationen, som alltför hög en tvättmedelskoncentration kan upplösa GUVs medan alltför låg koncentration kan orsaka proteinet att utvecklas eller aggregat.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein i Proteo-SUV kombineras med förformade, lipid-endast GUVs och fusion underlättas med speciella fusogena peptider 22 eller diskmedel 21. Vanligtvis omfattningen av fusion är begränsad vilket leder till GUVs med låg proteintäthet.
Dehydrering / Rehydrering: Ett proteininnehållande lipidfilm bildas genom partiell dehydratisering av en Proteo-SUV (eller Proteo-MLV) -lösning och GUVs odlas sedan som för en ren lipidfilm. Den uppenbara utmaningen är att skydda proteinet under den partiella dehydratipå steg 23, men metoden har framgångsrikt använts för att rekonstruera transmembranproteiner såsom Bacteriorhodopsin, Kalcium-ATPas, Grin och VDAC i GUVs 7,23 – 25.
Denna artikel beskriver dehydratisering / rehydrering protokoll för att göra GUVs innehållande den spänningsstyrda kaliumkanalen, KvAP, från hypertermofila arkéer, Aeropyrum pernix. KvAP har en hög grad av homologi med eukaryot spänningsberoende kaliumkanaler 26 och en känd kristallstruktur 27 , vilket gör det en bra modell för att studera mekanismen för spännings gating. Produktionen av Proteo-stadsjeepar har beskrivits i detalj tidigare och är inte en del av den här guiden 26,28,29. Viktigt do KvAP Proteo-stadsjeepar inte måste produceras för varje GUV beredning, eftersom de kan lagras i små (t.ex. 10 pl) portioner vid -80 ° C under längre tidsperioder (> 1 år). Electroformationeller gel-assisterad svullnad kan sedan användas för att odla GUVs från KvAP Proteo-SUV (eller Proteo-MLV).
De viktigaste stegen för electroformation protokoll illustreras i figur 1. Små droppar av en lösning av SUVs innehållande proteinet avsätts på platinatrådarna (visas i figur 2). Partiell dehydratisering av SUV suspensionen leder till bildning av en lipid-proteinfilm genom fusion av SUV. Under rehydrering, är en AC-fält som appliceras på elektroderna för att bistå lipidskikten att delaminera och bilda GUVs. En 10 Hz fält fungerar bra när man använder "låg salthalt" (<5 mM) rehydrering buffert 28 och GUVs ta flera timmar att växa. Däremot fysiologiska buffertar (innehållande ~ 100 mM salt) fungerar bra med en lägre spänning, 500 Hz AC fältet men kräver en långvarig (~ 12 timmar) svullnad perioden 15. Denna metod är baserad på en tidigare protokollet använder ITO glider 24, men använder en anpassad kammare fortsaining två platinatrådar som visas i figur 2 (se diskussionen om designdetaljer och förslag för enklare, improviserade kammare).
Figur 3 illustrerar gelén assisterade svullnad metoden. Protokollet fungerar bra med buffertar med fysiologiska saltkoncentrationer, är snabb, och producerar GUVs med en mer homogen proteinfördelning. Men (dvs, är GUV membran enhetlig vid optiska längdskalor och inte bifoga några föremål) utbytet av isolerade, synes felfri GUVs är lägre, även om det ger ett tillräckligt antal för patch-clamp och mikromanipuleringsförsök . Denna metod var baserad på ett protokoll med användning av agarosgel för att framställa lipid-enbart GUVs 16 och kräver mindre specialiserad utrustning än electroformation metoden.
Karakterisering av GUVs med fluorescensmikroskopi beskrivs, liksom förfaranden med en vanlig patch-clamp set-up tillmäta KvAP aktivitet i "inside-out" utskurna membran patchar.
Växande proteininnehållande GUVs kan vara svårare än lipid-enbart GUVs. I synnerhet kan den slutliga GUV utbytet beror känsligt på exakt hur SUV lösningen är deponerad och dehydratiseras för att bilda membranet stacken. För någon utan någon tidigare erfarenhet med GUVs, kan det vara till hjälp att först växa lipidfria endast GUVs efter en konventionell protokoll 15,16 i vilken membranet film bildas genom avsättning av lipider ur ett organiskt lösningsmedel. När den konventionella protokollet fungerar bra, kan SUV nedfall och partiell dehydratisering sedan bemästras med hjälp av lipid-bara SUV, som också till stor hjälp när du justerar protokollet för en ny lipidkomposition. När GUVs växer tillförlitligt från lipid-bara SUV, är det då bara ett litet steg för att producera proteininnehållande GUVs från Proteo-stadsjeepar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biomimetiska modellsystem är ett viktigt verktyg för att studera egenskaper och interaktioner mellan proteiner och membran. Jämfört med andra ombildade system som BLMs eller stöds lipidmembran, GUV baserade system som finns flera möjligheter, inklusive betydande kontroll över membransammansättning, spänning och geometri, samt vara helt oljefri. Att införliva transmembranproteiner, såsom KvAP, i GUVs kräver betydande anpassningar av konventionella protokoll för lipid-endast GUVs. Den electroformation Protoko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Materials
| Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
| matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
- Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. . Ion Channels of Excitable Membranes. , (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
